母鼠攝入高氟對(duì)仔鼠牙胚Rev-erbα及Runx2表達(dá)的影響.pdf

1、氟斑牙是氟中毒較早出現(xiàn)的對(duì)機(jī)體損害的臨床指標(biāo)。燃煤污染型氟斑牙是我國西南地區(qū)比較常見的氟斑牙類型。親代長期接觸過量氟除對(duì)親代自身造成各種損害外，氟還可通過胎盤屏障對(duì)子代發(fā)育帶來不良影響。有學(xué)者在對(duì)成釉細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)Rev-erbα可以調(diào)控核心結(jié)合因子α1(runt-related transcription factor2，Runx2)的表達(dá)同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Rev-erbα對(duì)釉原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶-20(Matrix Metalloprot

2、einase-20，MMP-20)和激肽釋放酶4(kallikrein4，KLK4)的調(diào)控作用與Runx2相反。但目前還未見Rev-erba在牙胚組織學(xué)定位研究的相關(guān)報(bào)道。
　　 目的：模擬病區(qū)高氟空氣環(huán)境及生活習(xí)慣復(fù)制燃煤型氟斑牙SD大鼠動(dòng)物模型，觀察Rev-erbα蛋白在子代大鼠牙胚中的組織學(xué)定位，并檢測Rev-erbα及Runx2的情況，以此來探討燃煤型氟斑牙發(fā)病的分子機(jī)制。
　　 方法：1.高氟空氣環(huán)境的復(fù)制：在

3、密閉的動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)置一無煙囪煤爐，以煤炭粘土比例為7:3的蜂窩煤為燃料模擬病區(qū)高氟空氣環(huán)境，白天為生火期約10小時(shí)，平均燃燒4個(gè)煤球，夜間為閉火期。在生火期和閉火期分別檢測飼養(yǎng)室內(nèi)空氣氟濃度。
　　 2.動(dòng)物模型的復(fù)制：實(shí)驗(yàn)選用健康的SD大鼠，3周齡，體重(60±5)g，共36只，雌雄比例2:1。將大鼠分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始實(shí)驗(yàn)。根據(jù)大鼠喂養(yǎng)飼料及環(huán)境的不同將其分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組18只大鼠，各組雌雄比例2:1。實(shí)驗(yàn)組飼養(yǎng)

4、于高氟空氣飼養(yǎng)室，飼料含氟濃度為40mg/kg，對(duì)照組飼養(yǎng)于普通飼養(yǎng)室，飼料含氟濃度為2.1mg/kg。建模第八周末將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠分別以雌雄比例2:1同籠，同籠期間繼續(xù)按照上述方法喂養(yǎng)直至仔鼠出生。
　　 3.建模開始后，每周稱量大鼠體重、測量下切牙牙長，觀察氟斑牙發(fā)生情況；每兩周采集一次血液標(biāo)本檢測血氟濃度。待雌雄交配成功并產(chǎn)仔后，取出生后第1、3、5、7、10、14天的仔鼠，體視顯微鏡下截取并分離其下頜骨及下切牙，4％

5、多聚甲醛固定，10％EDTA脫鈣兩周后石蠟包埋行下頜骨及下切牙牙胚聯(lián)合切片，HE染色觀察仔鼠牙胚發(fā)育所處階段及各階段成釉細(xì)胞在各個(gè)階段的形態(tài)學(xué)改變。采用免疫組織化學(xué)染色方法來觀察Rev-erbα蛋白在牙胚及成釉細(xì)胞發(fā)育過程中的組織學(xué)定位。同時(shí)還運(yùn)用熒光定量PCR來檢測Rev-erbα及Runx2在牙胚發(fā)育的不同階段中mRNA的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.飼料玉米含氟濃度：病區(qū)玉米76.27±9.042 mg/kg

6、，普通玉米2.03+0.20 mg/kg。
　　 2.實(shí)驗(yàn)組生火期平均空氣氟濃度為44.45±0.18μg/m3、閉火期為10.08±1.40μg/m3。對(duì)照組空氣氟濃度為0.62±0.07μg/m3。
　　 3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生長指標(biāo)的檢測：①大鼠一般情況及體重變化：燃煤高氟空氣環(huán)境下實(shí)驗(yàn)組大鼠較對(duì)照組反應(yīng)遲鈍、精神萎靡、體重增長緩慢，兩組間雌雄鼠體重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。②血氟含量：隨著攝氟時(shí)間的延長血氟

7、濃度逐漸增加，實(shí)驗(yàn)組呈明顯的上升趨勢，對(duì)照組血氟濃度較為穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血氟濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。③下切牙長度：隨著大鼠的增長，下切牙也不斷增長，在不同的時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組大鼠牙長均小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。④下切牙氟斑牙觀測：建模開始4周末可觀察到實(shí)驗(yàn)組大鼠下切牙表面出現(xiàn)棕白相間的橫紋，比較規(guī)則；6周末可見棕白相間的橫紋逐漸變得不規(guī)則，條紋間隙逐漸增大；8周末時(shí)可見實(shí)驗(yàn)組大鼠下切牙出現(xiàn)白堊色斑塊

8、及小面積的釉質(zhì)缺損，對(duì)照組大鼠牙外觀未見明顯改變。⑤仔鼠牙胚中成釉細(xì)胞HE染色形態(tài)學(xué)觀察：出生后第1天仔鼠牙胚的成釉細(xì)胞呈高柱狀，可見牙本質(zhì)形成，未見牙釉質(zhì)提示成釉細(xì)胞發(fā)育處于分泌前期；第3，5天仔鼠牙胚成釉細(xì)胞的胞核遠(yuǎn)離基底膜，并可見薄層牙釉質(zhì)形成，提示成釉細(xì)胞發(fā)育處于分泌期，實(shí)驗(yàn)組可見明顯的空泡變性和極性倒置；第7天，成釉細(xì)胞排列成柵欄狀，提示其發(fā)育處于轉(zhuǎn)換期，實(shí)驗(yàn)組可見空泡變性和極性倒置；第10天成釉細(xì)胞較第7天變短，第14天成釉

9、細(xì)胞呈扁平狀且牙釉質(zhì)脫落。提示成釉細(xì)胞發(fā)育分別處于成熟期和成熟晚期，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組成釉細(xì)胞排列紊亂。
　　 4.Rev-erbα在牙胚的組織學(xué)定位；Rev-erbα在仔鼠牙胚成釉器的蕾狀期，鐘狀期，分泌前期及成熟期成釉細(xì)胞的胞核表達(dá)。提示其可能參與成釉細(xì)胞的分化及發(fā)育。
　　 5.Rev-erbα mRNA實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在第1、3、5天時(shí)實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組，在第7、10、14