人參皂甙Rg1對絕經(jīng)后婦女阿爾茨海默病細胞模型的神經(jīng)保護作用及機理研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是以進行性加重的記憶認知功能減退為主要臨床特點的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD是引起癡呆的最常見原因，是老年人的常見病、多發(fā)病，最早是在1907年由德國醫(yī)師Alosis Alzeimer's報道。AD通常起病隱匿，為特點性、進行性病程，無緩解，由發(fā)病至死亡平行病程約8-10年，但也有些患者病程可持續(xù)15年或以上。AD主要病理學(xué)特征是在大腦皮層和海馬區(qū)域β-淀粉樣蛋白(beta-a

2、myloid protein，A B)沉淀形成的老年斑(senile plaque，SP)和tau蛋白異常磷酸化形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neur-ofillary tangles，NFT)以及出現(xiàn)彌漫性腦萎縮，表現(xiàn)為認知功能的進行性減退，伴有人格和情感控制等方面的異常以及日常生活能力的下降。
　　 有統(tǒng)計顯示：在美國65歲以上有1/10、85歲以上有近35％的人患AD，這樣計算下來美國有超過450萬AD患者，預(yù)計這一數(shù)據(jù)在2030

3、年將達到900萬人，2050年將達到2500萬人，目前，全世界有2500萬人有輕微的記憶障礙，很顯然幾年之后就會被診斷為AD。世界衛(wèi)生組織估計全球85歲以上人群中約有30％患有AD。在發(fā)達國家，AD已成為繼心臟病、癌癥、中風(fēng)之后的第四大疾病。AD的社會影響是極大的，僅在美國，每年用于AD的費用將近1100億美元。我國是一個人口大國，人口老齡化的速度會更快，現(xiàn)在我國60歲以上人口已經(jīng)超過10％，因而患癡呆的人數(shù)將有顯著增加，特別是在較高齡

4、人口中該病的患病率會成倍增長。國內(nèi)有學(xué)者對中國東北、西北、東南、西南4個地區(qū)3960萬人群進行分層、多級、整群抽樣研究，經(jīng)加權(quán)調(diào)整抽樣誤差后的結(jié)果顯示，55歲以上人群AD患病粗略合計為2.0％，65歲以上為3.5％。日趨增多的AD患者將會給患者家庭及社會帶來極大危害。
　　 近來研究發(fā)現(xiàn)，除年齡、遺傳和環(huán)境因素外，性激素，尤其是雌激素也在AD的發(fā)病中有重要的作用。流行病學(xué)研究顯示，AD的發(fā)病有明顯的性別差異，女性和男性患者之比為

5、2:1-3:1。除了女性平均壽命較長的原因外，絕經(jīng)后婦女體內(nèi)雌激素水平的迅速下降增加了其對AD的易感性，提示雌激素不足與AD之間存在某種聯(lián)系，雌激素缺乏可能是AD的危險因素。因此，女性絕經(jīng)后老年癡呆已成為AD的重要類型。雌激素替代治療(ERT)能延緩女性AD患者的發(fā)病年齡。然而，我們也不得不認識到ERT所帶來的弊端。應(yīng)用ERT的婦女，不論是否已做子宮切除術(shù)，卵巢癌、乳腺癌等發(fā)病危險均有所增加，而且發(fā)病危險與ERT使用時間成正比。這是目前

6、制約ERT在臨床上應(yīng)用的一個主要原因。因此，具有雌激素樣作用的中藥單藥或者復(fù)方的研究受到了越來越多的關(guān)注。中醫(yī)理論認為“心主藏神”、“腎主骨髓”、“腦為元神之府”，心之氣血不足，腎之精氣虧損，腦之髓海失充為導(dǎo)致記憶障礙的關(guān)鍵。人參性稟中和，功善滋補強壯，是傳統(tǒng)大補元氣，調(diào)神益智的常用中藥。人參皂苷Rg1是已發(fā)現(xiàn)的40多種人參皂苷中研究較多的一種人參單體，其主要的靶器官是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明人參皂甙Rg1是人參作用于神經(jīng)系統(tǒng)和

7、促智的主要有效成分之一，具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力和增強記憶力等作用。
　　 本研究選用Aβ25-35作用于原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元作為AD的細胞模型，通過流式細胞儀檢測人參皂甙Rg1的抗神經(jīng)元凋亡作用，并且應(yīng)用熒光實時定量PCR(realtime PCR)及Western Blot檢測凋亡相關(guān)因子以及雌激素受體的表達以探討人參皂甙Rg1神經(jīng)保護作用的機制，從而為臨床相關(guān)疾病的治療提供科學(xué)依據(jù)。
　　 目的：

8、　　 本實驗研究選用Aβ25-35作用于原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元作為AD的細胞模型，探討人參皂甙Rg1的類雌激素樣神經(jīng)保護作用機制，為臨床相關(guān)疾病的治療提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 本研究共分為以下兩個部分：
　　 第一部分原代神經(jīng)元的培養(yǎng)及阿爾茨海默病細胞模型的制備
　　 取新生24小時內(nèi)的Wistar大鼠，剝離腦膜、分離出海馬，加入0.125％胰蛋白酶溶液消化，用含有10％胎牛血清的DMEM/

9、F12培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打制成單細胞懸液，于37℃孵箱中孵育，定時在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況。將經(jīng)過多聚賴氨酸包被的玻片鋪于24孔板中，將細胞接種在玻片上，體外原代培養(yǎng)7天后，采用免疫細胞化學(xué)染色方法，檢測神經(jīng)元特異性標(biāo)記物--Microtubule-associated protein-2(MAP-2)的表達。
　　 將Aβ25-35用生理鹽水溶解，然后用DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋，過濾滅菌，分裝在EP管中置

10、于-20℃冰箱保存，用前在37℃孵箱中孵育7天。海馬神經(jīng)元培養(yǎng)7天后，加入老化處理好的Aβ25-35，使Aβ25-35的終濃度分別為0μmol/1、2.5μmol/1、5μmol/1、7.5μmol/1、10μmol/l，分別作用24h、48h、72h，用MTT法及LDH檢測細胞活力，從而確定合適的Aβ25-35作用濃度及作用時間。
　　 第二部分人參皂甙Rg1緩解Aβ25-35引起的細胞毒性作用及機理研究
　　 MTT

11、法及LDH的測定來檢測人參皂甙Rg1緩解Aβ25-35的細胞毒性作用；AnnexinV/PI雙染法檢測人參皂甙Rg1對抗Aβ25-35所導(dǎo)致的細胞凋亡；實時定量RT-PCR法檢測Bcl-2、Bax、caspase3、ERα、ERβ mRNA的表達，免疫印記法(Western blot)檢測Bcl-2、Bax、active caspase3、ERα、ERβ蛋白的表達。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分原代神經(jīng)元的培養(yǎng)及阿爾茨海

12、默病細胞模型的制備
　　 1.Aβ25-35損傷模型的制備Aβ25-35的神經(jīng)元毒性呈劑量和時間依賴性。各濃度Aβ25-35作用時間為24h和48h時，均未對神經(jīng)元產(chǎn)生明顯的細胞毒性，而在作用時間為72h時的細胞毒性明顯增強。MTT和LDH結(jié)果均顯示，相比其他作用濃度Aβ25-35在濃度為5μmol/l時對神經(jīng)元的細胞毒性作用最大并且之后達到一個平臺期。因此，我們最終選擇5μmol/1的Aβ25-35作用72h來進行進一步的實驗

13、。
　　 2.神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變神經(jīng)元在培養(yǎng)到大約第7天時，胞體形態(tài)飽滿，呈錐形或梭形，折光性強，有明顯立體感，核仁清晰可見，突起增多、增粗、變長，并出現(xiàn)末端分枝，連成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。Model組與Control組相比較，細胞數(shù)目有所減少，折光性減弱，部分細胞變圓，細胞核呈固縮狀態(tài)，胞體腫脹，失去原有形態(tài)，神經(jīng)元突起減少、變短甚或消失。人參皂甙Rg1各組和E2組與Model組相比較，細胞損傷相對較小，細胞形態(tài)基本完好。
　　 第

14、二部分人參皂甙Rg1緩解Aβ25-35引起的細胞毒性作用及機理研究
　　 1.人參皂甙Rg1緩解Aβ25-35的細胞毒性作用MTT和LDH結(jié)果均顯示，Model組的細胞活力明顯低于Control組(P<0.01)：相比Model組，人參皂甙Rg1各組和E2組的細胞活力均有提高，均有顯著性意義(P<0.01或P<0.05)；E2組的細胞活力高于Rg110-8M組、Rg110-7M組和Rg110-6M組，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05

15、)。
　　 2.人參皂甙Rg1對抗Aβ25-35所導(dǎo)致的細胞凋亡熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，早期凋亡的細胞表現(xiàn)為細胞膜綠色熒光染色而細胞核無染色；晚期凋亡的細胞表現(xiàn)為AnnexinV和PI雙染，即胞膜綠染、核紅染。Control組各個時期凋亡細胞均極少；Model組較多細胞膜綠染，也有少數(shù)細胞核紅染；而加入雌激素和人參皂甙Rg1后，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞數(shù)目均明顯減少。流式細胞儀分析結(jié)果示：Model組早期凋亡細胞的數(shù)量明顯多于C

16、ontrol組(P<0.01)；人參皂甙Rg1各組和E2組早期凋亡細胞的數(shù)量與Model組比較均有所減少(P<0.05)；E2組與Rg110-7M組和Rg110-6M組早期凋亡細胞的數(shù)量大致相當(dāng)，無顯著性差異(P>0.05)，但是均比Rg110-8M組有明顯降低(P<0.05)。
　　 3.實時定量RT-PCR法檢測Bcl-2、Bax、caspase3、ERα、ERβ mRNA的表達(1)Bcl-2 mRNA表達比較Model組

17、Bcl-2 mRNA的表達較Control組有所增高(P<0.01)，人參皂甙Rg1各組和E2組Bcl-2 mRNA的表達均比Model組有所提高(P<0.01或0.05)；(2)Bax mRNA表達比較Model組Bax mRNA的表達比Control組明顯增高(P<0.01)，人參皂甙Rg1各組和E2組mRNA的表達水平較Control組均有顯著降低(P<0.01或P<0.05)：(3)Bcl-2/Bax mRNA表達比較與Cont

18、rol組比較，Model組Bcl-2/Bax的比值明顯降低(P<0.01)，人參皂甙Rg1各組和E2組Bcl-2/Bax的比值較Model組顯著提高(P<0.01或P<0.05)；(4)caspase3 mRNA表達比較與Control組比較，Model組caspase3 mRNA的表達顯著升高(P<0.01)，人參皂甙Rg110-7M組、人參皂甙Rg110-6M組和E2組caspase3 mRNA的表達較Model組均有明顯降低(P<

19、0.01)，但是人參皂甙Rg110-8M組caspase3 mRNA的表達與Model組比較沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；(5)ERαmRNA表達比較Control組有ERαmRNA的表達，Model組比Control組ERαmRNA表達顯著降低(P<0.05)，人參皂甙Rg1各組和E2組ERαmRNA表達水平相比Model組則有所提高，但是沒有顯著性差異(P>0.05)；(6)ERβmRNA表達比較Control組有ERβ mRNA

20、的表達，與Control組比較，Model組ERβ mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)，人參皂甙Rg1各組和E2組ERβ mRNA表達水平較Model組有顯著提高(P<0.01或P<0.05)。
　　 4.免疫印記法(Western blot)檢測Bcl-2、Bax、active caspase3、ERβ、ERβ蛋白的表達水平(1)Bcl-2蛋白表達比較Model組Bcl-2蛋白的表達較Control組增高(P<0.05)

21、，人參皂甙Rg1各組和E2組Bcl-2蛋白的表達均比Model組有所提高(P<0.01或(P<0.05)，在人參皂甙Rg1各組和E2組中Rg110-7M組Bcl-2蛋白的表達最高，但無顯著性差異(P>0.05)；(2)Bax蛋白表達比較與Control組比較，Model組Bax蛋白表達水平明顯增高(P<0.01)，人參皂甙Rg1各組和E2組Bax蛋白表達水平較Control組均有顯著降低(P<0.05)；(3)Bcl-2/Bax表達比較

22、與Control組比較，Model組Bcl-2/Bax的值明顯降低(P<0.01)，人參皂甙Rg1各組和E2組Bcl-2/Bax的值較Model組顯著提高(P<0.01)，其中E2組Bcl-2/Bax的比值提高最多，但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；(4)active caspase3蛋白表達比較Model組active caspase3蛋白表達水平高于Control組(P<0.01)，與Model組比較，人參皂甙Rg1各組和E2組a

23、ctive caspase3蛋白表達水平均有降低(P<0.01或P<0.05)。(5)ERα蛋白表達比較Control組有ERα蛋白表達，Model組ERα蛋白表達較Control組明顯降低(P<0.01)，與Model組相比，人參皂甙Rg1各組和E2組ERα蛋白表達均有所提高，但是沒有顯著性差異(P>0.05)；(6)ERβ蛋白表達比較Control組有ERβ蛋白表達，Model組比Control組ERβ蛋白表達顯著降低(P<0.01

24、)，加入人參皂甙Rg1和E2后ERβ蛋白表達水平均有顯著提高(P<0.05或P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.人參皂甙Rg1與雌激素都能夠緩解Aβ25-35的神經(jīng)元毒性作用。人參皂甙Rg1的神經(jīng)保護作用可能與其能對抗Aβ25-35所導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)。
　　 2.人參皂甙Rg1與雌激素均可以增加抗凋亡因子Bcl-2 mRNA及蛋白水平的表達、降低促凋亡因子Bax mRNA及蛋白水平的表達，從而上調(diào)了

25、Bcl-2/Bax的比值，并最終引起了caspase3 mRNA和active caspase3蛋白水平表達的降低，這可能是人參皂甙Rg1的抗神經(jīng)元凋亡作用機理之一。
　　 3.體外培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元中ERα、ERβ共表達，ERβ的表達是ERα表達的2.3倍。
　　 4.雌激素受體表達減少在AD發(fā)病中起重要作用。人參皂甙Rg1的神經(jīng)保護作用原因之一是因為其具有類雌激素樣作用，并且這種作用主要是通過ERβ來實現(xiàn)的而不是E