白藜蘆醇降低長(zhǎng)鏈非編碼RNAAK001796表達(dá)抑制惡性細(xì)胞生長(zhǎng).pdf

1、背景與目的：
　　長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200nt的RNA，其本身并不編碼蛋白質(zhì)，而是以RNA的形式在多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)水平。越來(lái)越多的研究表明，lncRNA不僅參與物種進(jìn)化、胚胎發(fā)育、物質(zhì)代謝、基因組印記等，而且異常表達(dá)的lncRNA與人類疾病密切相關(guān)，尤其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。肺癌的發(fā)病率和死亡率位居全球居民癌癥的首位，在中國(guó)

2、等遠(yuǎn)東國(guó)家肺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，吸煙和二手煙暴露是其主要環(huán)境危險(xiǎn)因素，并且約90％的肺癌發(fā)生與吸煙相關(guān)。作為多環(huán)芳(香)烴(polycyclic aromatic hydrocarbon)家族典型代表的苯并[a]芘（benzo(a)pyrene，B[a]P）是吸煙產(chǎn)生的主要的致癌物之一。苯并[a]芘經(jīng)過(guò)體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化形成的活性代謝產(chǎn)物反式-7,8-二羥-9,10-環(huán)氧苯并芘（anti-benzo(a)pyrene-7,8-diol-

3、9,10-epoxide，anti-BPDE）已被證實(shí)具有強(qiáng)烈的致癌性，但對(duì)其致癌作用機(jī)制還不完全明了。白藜蘆醇（resveratrol）是一種由植物合成的對(duì)抗外來(lái)病原的多酚類化合物，廣泛存在于多種植物體內(nèi)，在癌癥的化學(xué)預(yù)防和治療中具有特殊的功能。已有研究表明 microRNA在白藜蘆醇的抗癌過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，這為我們研究白藜蘆醇的抗癌作用機(jī)制提供了新的線索。本課題即是研究白藜蘆醇抗癌過(guò)程中異常表達(dá)的lncRNA在肺癌化學(xué)預(yù)防及治療

4、中的作用，揭示lncRNA在惡變的支氣管上皮細(xì)胞和肺癌細(xì)胞株中的功能。
　　方法：
　　1.白藜蘆醇對(duì)肺癌細(xì)胞及惡變的支氣管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響以不同濃度的白藜蘆醇處理人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞及aiti-BPDE誘導(dǎo)惡變的人支氣管上皮細(xì)胞，處理48 h后用CCK-8試劑和酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。檢測(cè)步驟按試劑盒說(shuō)明書執(zhí)行。
　　2.白藜蘆醇誘導(dǎo)lncRNA表達(dá)譜改變 A549細(xì)胞經(jīng)25μmol/L的白藜蘆醇處理48 h

5、后利用lncRNA基因芯片分析給予化學(xué)預(yù)防劑白藜蘆醇處理前后lncRNA表達(dá)譜的改變。
　　3. lncRNA表達(dá)水平的檢測(cè)用SYBR Green染料法對(duì)lncRNA進(jìn)行qRT-PCR定量檢測(cè)。
　　4.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小分子干擾RNA（siRNA）利用脂質(zhì)體Lipofectamine-2000將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染步驟按試劑盒說(shuō)明書執(zhí)行。待細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收獲細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行qRT-PCR定量檢測(cè)干擾效率。

6、　　5.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)把待轉(zhuǎn)染細(xì)胞按3×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，24 h后分組進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，在酶標(biāo)儀上用CCK-8試劑盒檢測(cè)每組細(xì)胞的增殖能力。檢測(cè)步驟按試劑盒說(shuō)明書執(zhí)行。
　　6.細(xì)胞周期檢測(cè)將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)24 h后，利用脂質(zhì)體Lipofectamine-2000將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，48h后消化收集細(xì)胞，經(jīng)PI染色后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。
　　7.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，

7、用0.25%不含EDTA的胰酶消化液收獲細(xì)胞，用Annexin V-FITC試劑盒和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　8. shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染利用脂質(zhì)體 Lipofectamine-2000將shRNA導(dǎo)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24 h后，用400μg/ml的G418進(jìn)行篩選，約2月后收獲細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行qRT-PCR定量檢測(cè)干擾效率。
　　9.軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)每孔加2 ml0.3%低熔點(diǎn)瓊脂糖細(xì)胞

8、混合液（1000個(gè)cell/孔）于已鋪好含2 ml0.6%底層瓊脂的6孔板里，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周后，計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆。
　　10.裸鼠成瘤試驗(yàn)將培養(yǎng)好的各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞用胰酶消化收獲，離心后用PBS溶液重懸，計(jì)數(shù)細(xì)胞密度并調(diào)整各組細(xì)胞密度統(tǒng)一，在每只 BALB/c裸鼠的腹股溝皮下注射200μl約含4×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液。密切觀察成瘤情況，并每周測(cè)量腫瘤體積，4周后處死裸鼠，取出腫瘤測(cè)量并稱重。
　　11.統(tǒng)計(jì)分析采

9、用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以 sx±表示，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均至少3次重復(fù)。兩組間比較用雙側(cè)Student’s t-test；3組以上的比較采用單因素方差分析，所有檢驗(yàn)均以雙側(cè)P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.白藜蘆醇抑制A549細(xì)胞及16HBE-T細(xì)胞的生長(zhǎng)0-100μmol/L的白藜蘆醇處理A549細(xì)胞及16HBE-T細(xì)胞48 h后細(xì)胞增殖受到明顯抑制，并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。
　　2

10、.白藜蘆醇處理前后lncRNA表達(dá)譜改變 A549細(xì)胞經(jīng)25μmol/L的白藜蘆醇處理48 h后進(jìn)行l(wèi)ncRNA基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)21個(gè)lncRNA表達(dá)上調(diào)、19個(gè)lncRNA表達(dá)下調(diào)。選取下調(diào)表達(dá)最明顯的AK001796進(jìn)一步研究其功能。
　　3. AK001796的表達(dá)水平檢測(cè)與DMSO溶劑對(duì)照組相比，25μmol/L白藜蘆醇處理48 h后的A549細(xì)胞、H446細(xì)胞和惡性轉(zhuǎn)化的16HBE-T細(xì)胞中AK001796的表達(dá)水平均

11、明顯下調(diào)。而與正常人支氣管上皮細(xì)胞16HBE和BEAS-2B細(xì)胞相比，A549細(xì)胞、H446細(xì)胞和16HBE-T細(xì)胞中AK001796明顯高表達(dá)。
　　4.轉(zhuǎn)染siRNA及shRNA后AK001796的表達(dá)變化 A549細(xì)胞、H446細(xì)胞和16HBE-T細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA48 h后及shRNA篩選約2月后，AK001796的表達(dá)水平均明顯下調(diào)，選取干擾效果最佳的siRNA-3進(jìn)行后續(xù)研究。
　　5.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力改變轉(zhuǎn)染

12、48 h后，siRNA-3組處理的A549細(xì)胞（60.06±4.00）%及H446細(xì)胞（84.06±4.00）%和16HBE-T細(xì)胞（65.02±5.35）%的細(xì)胞活力顯著下降，與siRNA-NC組相比差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　6.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期分布改變轉(zhuǎn)染48 h后，siRNA-3組處理的A549細(xì)胞和16HBE-T細(xì)胞的G2/M期和S期細(xì)胞比例明顯減少，而G0/G1期細(xì)胞比例則明顯增多，與siRNA-NC組相比

13、差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　7.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后，siRNA-3組處理的A549細(xì)胞和16HBE-T細(xì)胞的凋亡率與siRNA-NC組相比差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　8.軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn) A549細(xì)胞shRNA轉(zhuǎn)染組集落形成率降低到（29.33±4.16），與shRNA-NC組（65.00±10.54）相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　9.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) A549細(xì)

14、胞shRNA轉(zhuǎn)染組的腫瘤重量(80.20±42.08 mg)和腫瘤體積(152.54±57.37 mm3)均明顯低于 shRNA-NC組的重量(271.56±115.84 mg)和體積（455.01±214.03 mm3)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.在肺癌細(xì)胞株和惡性轉(zhuǎn)化的人支氣管上皮細(xì)胞16HBE-T中AK001796均高表達(dá)，經(jīng)白藜蘆醇處理后均低表達(dá)。
　　2. AK001796表