基于體內(nèi)過(guò)程的蒲黃—五靈脂藥對(duì)功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、蒲黃-五靈脂藥對(duì)始載于《證類(lèi)本草》卷二十二引《近效方》，稱(chēng)為失笑散，是由蒲黃、五靈脂兩味中藥組成，具有活血化瘀消結(jié)止痛的功效。主治瘀血停滯癥;心腹刺痛，產(chǎn)后惡露不行，或月經(jīng)不調(diào)，少腹急痛等。蒲黃-五靈脂藥對(duì)為治療瘀血疼痛的常用方，臨床上主要用于治療由于血瘀癥引起的相關(guān)病癥，在婦科疾病中療效尤其顯著。現(xiàn)代研究表明，蒲黃—五靈脂藥對(duì)的有效成分主要有甾類(lèi)、黃酮、多糖、有機(jī)酸、萜類(lèi)、氨基酸、揮發(fā)油等，并具有安神、止痛、抗血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬

2、化等藥理作用。本論文以蒲黃—五靈脂藥對(duì)為研究切入點(diǎn)，對(duì)蒲黃-五靈脂效應(yīng)物質(zhì)群在動(dòng)物體內(nèi)過(guò)程進(jìn)行研究，針對(duì)其效應(yīng)成分群、藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布特征、動(dòng)物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物鑒定與分析以及效應(yīng)成分群對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集和抗凝血作用等方面開(kāi)展研究工作，以探討其體內(nèi)直接藥效物質(zhì)與作用機(jī)制，為了進(jìn)一步研究它的作用機(jī)理和其治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，揭示其臨床治療疾病的作用機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。為臨床合理用藥提供一定參考。全文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下:
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3、.蒲黃-五靈脂藥對(duì)配伍前后效應(yīng)成分群的高效液相色譜—二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-PDA)分析。采用HPLC-PDA法同時(shí)分析測(cè)定樣品中沒(méi)食子酸、原兒茶酸、香草酸、對(duì)香豆酸、香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的含量，結(jié)果表明，蒲黃、五靈脂配伍后香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷溶出增加，均高于蒲黃單煎液和單煎混合液;而沒(méi)食子酸、原兒茶酸、香草酸、對(duì)香豆酸4個(gè)有機(jī)酸類(lèi)成分經(jīng)配伍后溶出量低于單煎液，但高于單煎混合液。以評(píng)價(jià)蒲黃-五靈脂

4、配伍前后化學(xué)成分的溶出變化為進(jìn)一步體內(nèi)過(guò)程研究提供方法參考。
　　2.超高液相色譜飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-QTOF-MS-Markerlynx)聯(lián)用技術(shù)分析蒲黃-五靈脂藥對(duì)效應(yīng)成分群。應(yīng)用UPLC-QTOF-MS-Markerlynx聯(lián)用技術(shù)及主成分分析法(PCA)和正交偏最小二乘判別法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)蒲黃五靈脂合煎液、合并液中的主要化學(xué)成分進(jìn)行分析，追蹤煎煮過(guò)程化學(xué)成分的變化，從化學(xué)成分變化的角度闡述二者配伍的科學(xué)內(nèi)涵。結(jié)

5、果表明，蒲黃-五靈脂配伍分煎混合液與合煎液總離子流色譜峰存在顯著差異，對(duì)有變化的碎片離子峰進(jìn)行分析鑒定，共鑒定出5具有顯著差異的化合物，分別為香蒲新苷、柚皮素、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷，槲皮素-3-O-新橙皮糖苷，山柰酚-3-O-新橙皮糖苷。提示經(jīng)合煎后可能會(huì)促進(jìn)該藥對(duì)中的黃酮類(lèi)成分的溶出。存在較大差異的色譜峰尚包括五靈脂中的成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)的確認(rèn)尚需進(jìn)一步研究。
　　3.蒲黃五靈脂藥對(duì)主要效應(yīng)成分群的藥代動(dòng)力學(xué)研究及組織分布特

6、征分析。采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法(UPLC-TQ/MS)建立了同時(shí)測(cè)定蒲黃五靈脂水提取物中對(duì)香豆酸、香草酸和香蒲新苷3種主要成分在血漿中的定量分析方法，該方法具有高選擇性、高靈敏度、精密準(zhǔn)確。藥動(dòng)學(xué)結(jié)果說(shuō)明，單味藥蒲黃組中香草酸、對(duì)香豆酸Cmax、AUCOT低于蒲黃-五靈脂合煎組(P＜0.05)，說(shuō)明兩藥合用后吸收程度提高。同時(shí)單味藥Tmax與藥對(duì)組比顯著縮短(P＜0.05)，說(shuō)明蒲黃五靈脂合用后香草酸、香蒲新苷吸收速率增

7、大、消除速率均變慢從而延長(zhǎng)藥效。結(jié)果表明蒲黃-五靈脂藥對(duì)配伍前后有機(jī)酸類(lèi)和黃酮類(lèi)成分等效應(yīng)物質(zhì)的藥動(dòng)學(xué)特征，其差異性可為藥對(duì)配伍合理性研究提供相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)藥動(dòng)學(xué)研究提供了可以借鑒的方法。組織分布結(jié)果顯示，對(duì)香豆酸在大鼠體內(nèi)分布主要集中于肝臟、脾臟及肺部，香草酸、香蒲新苷主要分布于肝臟、腎臟與肺部。三種成分主要分布于血供豐富的臟器，在胸腺等血流不豐富的臟器中幾乎不分布，且因其極性較大，較難通過(guò)血腦屏障，因此腦中幾乎檢測(cè)不到。蒲黃、五靈脂配

8、伍可顯著促進(jìn)對(duì)香豆酸、香草酸和香蒲新苷在心、肝、肺腎等臟器的分布。
　　4.蒲黃-五靈脂主要效應(yīng)成分群在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物分析與鑒定。對(duì)蒲黃-五靈脂藥對(duì)主要效應(yīng)成分群在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定與分析研究，鑒定了蒲黃-五靈脂藥對(duì)在大鼠血漿、尿液、膽汁中有機(jī)酸及黃酮類(lèi)成分的代謝物，從蒲黃-五靈脂合煎液給藥后大鼠血漿、尿液、膽汁中初步鑒定了29個(gè)代謝產(chǎn)物成分，分別為沒(méi)食子酸的3個(gè)代謝產(chǎn)物，原兒茶酸的5個(gè)代謝產(chǎn)物，香草酸的8個(gè)代謝產(chǎn)物，

9、香蒲新苷的3個(gè)代謝產(chǎn)物，異鼠李素3-O-新橙皮糖苷的3個(gè)代謝產(chǎn)物，對(duì)香豆酸的7個(gè)代謝產(chǎn)物。主要代謝途徑有羥化、甲基化、磺化、葡糖醛酸化、去甲基化、失氧等多種類(lèi)型。
　　5.基于代謝組學(xué)的蒲黃-五靈脂作用機(jī)理探討。采用冰水浴并注射鹽酸腎上腺素法制備大鼠寒凝血瘀大鼠模型，運(yùn)用UPLC-Q-TOF/MS聯(lián)用技術(shù)分析給予蒲黃-五靈脂藥對(duì)后大鼠血漿、尿液和膽汁中內(nèi)源性代謝物圖譜的變化，并使用模式識(shí)別技術(shù)分析正常組、模型組及給藥組間血漿、尿液

10、及膽汁的內(nèi)源性代謝物差異，找到與蒲黃-五靈脂藥對(duì)活血化瘀功效密切相關(guān)的潛在10個(gè)生物標(biāo)記物;分析蒲黃-五靈脂藥對(duì)對(duì)潛在生物標(biāo)志物。結(jié)果表明，蒲黃五靈脂具有活血化瘀功效并對(duì)寒凝血瘀證具有一定的修復(fù)作用。且寒凝血瘀證狀態(tài)下，大鼠尿液中與能量代謝相關(guān)的葡糖醛酸水平下降，說(shuō)明寒凝血瘀證模型大鼠血糖反應(yīng)降低，三羧酸循環(huán)減弱，長(zhǎng)時(shí)間的能量不足，需要一些能量代謝的旁路途徑進(jìn)行代償，導(dǎo)致戊糖和葡萄糖醛酸互變代謝發(fā)生異常。
　　6.蒲黃-五靈脂配伍

11、對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集和抗凝血作用研究。采用體外ADP誘導(dǎo)的血小板聚集、凝血酶時(shí)間(TT)和凝血酶原時(shí)間(PT)法，對(duì)蒲黃、五靈脂配伍前后單煎、分煎、合煎液有機(jī)酸、黃酮類(lèi)化合物及單體化合物的變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明，蒲黃五靈脂合煎液、蒲黃五靈脂合并液均有顯著的抗血小板聚集和延長(zhǎng)凝血酶時(shí)間活性。同樣生藥劑量下，蒲黃五靈脂合煎液凝血酶時(shí)間(TT)延長(zhǎng)率大于分煎混合液。蒲黃五靈脂合煎液及分煎混合液與空白對(duì)照組比較均具有顯著抑制血小板聚集活性(