江浙蝮蛇蛇毒激肽釋放酶在麥胚無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)中的表達(dá)和優(yōu)化.pdf

1、本研究在成功克隆得到江浙蝮蛇蛇毒激肽釋放酶目的基因的基礎(chǔ)上，在蛇毒激肽釋放酶基因序列上引入BamHI和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)以及由六個(gè)組氨酸組成的組氨酸標(biāo)簽，并將其與pCS2+表達(dá)載體相連，構(gòu)建了質(zhì)粒pCS2+/VK，經(jīng)過酶切測(cè)序驗(yàn)證插入方向正確且未引起堿基序列的變化。
　　將pCS2+/VK線性化后，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到適合進(jìn)行翻譯的模板mRNA。再將mRNA同自制麥胚抽提物以及翻譯緩沖液混合，26°C孵育16h，將反應(yīng)后的混合物進(jìn)

2、行SDS-PAGE電泳，能夠得到一條大約43kDa的條帶，經(jīng)Westernblot驗(yàn)證為所需要目的蛋白。
　　麥胚無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)在安全準(zhǔn)確的合成功能蛋白方面具有很大的潛力，但是能源物質(zhì)的供應(yīng)以及模板mRNA的穩(wěn)定性一直是影響系統(tǒng)產(chǎn)率的主要因素。本文中磷酸肌酸和丙酮酸作為提供ATP二次能源物質(zhì)加入系統(tǒng)中，在對(duì)蛋白產(chǎn)率進(jìn)行比較之后，發(fā)現(xiàn)磷酸肌酸更適合于麥胚無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)；為了提高mRNA模板穩(wěn)定性，向系統(tǒng)中補(bǔ)充了質(zhì)粒載體、SP

3、6RNA聚合酶以及銅離子，并對(duì)這些條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終建立了一個(gè)高效快速的麥胚無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)。當(dāng)向系統(tǒng)中加入30ng/μL質(zhì)粒載體、15USP6RNA聚合酶、25mM磷酸肌酸以及5mMCu2+后，并在26°C反應(yīng)16h時(shí)，蛇毒激肽釋放酶產(chǎn)量從0.13mg/mL提高到0.74mg/mL。
　　通過固定化金屬親和層析法(IMAC)對(duì)重組蛇毒激肽釋放酶進(jìn)行分離純化，將純化后的蛋白透析凍干，將重組蛋白(1.3U/mg)與天然蛇毒激肽釋