重組IL-24蛋白抑制胃癌生長及其作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文研究目的：研究hIL-24基因重組的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3．0-hIL-24在CHO細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-21a(+)-hIL-24在大腸桿菌中高效表達(dá)的產(chǎn)物經(jīng)部分純化、復(fù)性后的rhIL-24蛋白對胃癌細(xì)胞(SGC7901)及胃癌裸鼠模型的抗腫瘤效應(yīng)及其分子機(jī)理。 研究方法：應(yīng)用蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞和分子生物學(xué)教研室構(gòu)建的pUCl9-hlL-24和質(zhì)粒pcDNA3．O，構(gòu)建出高效的真核表達(dá)載體pcDNA3．0

2、-hIL-24。鑒于中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO的表達(dá)特性，將真核表達(dá)載體pcDNA3．0rhlI．-24轉(zhuǎn)染ClIO細(xì)胞，使rhIL-24在其中穩(wěn)定、高效的表達(dá)。pcDNA3．O-hIL-24重組質(zhì)粒，經(jīng)鑒定后轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，然后測定CHO培養(yǎng)上清中的rhIL-24的生物學(xué)活性。同時以蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞和分子生物學(xué)教研室構(gòu)建的pBV220-hIL-24載體為模板，用分別含有BamHI、XhoI酶切位點(diǎn)的hIL-24上、下游引物進(jìn)行PCP,．

3、擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物用BamHI和XhoI雙酶切后與pET-21a(+)質(zhì)粒連接，構(gòu)建pET-21a(+)-hIL-24的重組表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定重組子后測序。將測序正確的pET-21a(+)-hrL-24重組質(zhì)粒抽提后轉(zhuǎn)化BL-21菌株，挑取陽性克隆。振蕩培養(yǎng)過夜。接種LA培養(yǎng)基，370(2氣浴搖菌至OD600≈0．4,～0．6時，加入IPTG，誘導(dǎo)不同時間(2、3、4、5h)后，分別取樣。離心取菌體，經(jīng)反復(fù)超

4、聲破碎，將包涵體進(jìn)行洗滌，溶包，復(fù)性后透析，獲得部分純化的rhlL-24蛋白，用Western-blot進(jìn)行鑒定。MTT法評價CHO上清中的rhIL-24及部分純化的原核表達(dá)的rhIL-24蛋白對胃癌細(xì)胞SGC7901生長的影響，繪制細(xì)胞生長曲線；ELISA法檢測原核表達(dá)的rhlL-24蛋白刺激PBMC分泌IL-6、TNF-α和IFN-γ的活性；FCM檢測rhIL-24對SGC7901細(xì)胞周期和凋亡的影響；選用8～9日齡的雞胚，觀察rh

5、IL-24對雞胚尿囊膜(CAM)微血管生成的影響作用；將100μ1(約106)SGC7901胃癌細(xì)胞注射于裸鼠腋部外側(cè)皮下，建立人胃癌裸鼠移植瘤模型，待腫瘤長至約5mm時，分別于瘤體內(nèi)注射rhIL-24蛋白、真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3．0-hIL-24、順鉑和PBS，三天一次，每次注射前稱重及測量腫瘤大小。注射五次后處死所有裸鼠，取出腫瘤稱重、計算抑制瘤體積和抑瘤率，免疫組化法測定移植瘤中BAX、BCL-2、CD34、VEGF等的表達(dá)。

6、 研究結(jié)果： 構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3．0-hIL-24及原核表達(dá)載體pET-21a(+)-hIL-24，經(jīng)雙酶切和PCR鑒定后提示表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。獲得了全長的hIL-24基因片段，與GeneBank報導(dǎo)的hIL-24序列完全一致。pcDNA3．0-hlL-24表達(dá)質(zhì)粒在CHO細(xì)胞中獲得了穩(wěn)定的表達(dá)，上清中rhIL-24蛋白濃度為90uffml。重組工程菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)3h后，其表達(dá)rML-24蛋白的效率可達(dá)菌體

7、總蛋白的40％左右，初步純化的rhIL-24蛋白濃度為150μg／ml。由原核和真核細(xì)胞表達(dá)的rhIL-24均能顯著抑制SG-C7901細(xì)胞的生長，其抑制作用具有明顯的時間依賴性，F(xiàn)CM檢測顯示rhIL-24能使SGC7901細(xì)胞出現(xiàn)G2／M阻滯，并出現(xiàn)明顯凋亡峰。rhlI,-24刺激PMBC48h后，IL-6、TNF-α、IFN-γ的表達(dá)水平顯著升高，至72h分泌達(dá)到高峰，與對照組相比，差異具有顯著性(p<0．01)。雞胚尿囊膜微血管

8、(CAM)形成抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，rhIL-24蛋白與平陽霉素(陽性對照)一樣均可顯著抑制微血管形成。其中對二級和三級血管的抑制效果明顯，與陰性對照組比較，差異具有顯著性(p

9、4蛋白組和pcDNA3．0-hIL-24質(zhì)粒組移植瘤中BCL-2、VEGF和微血管密度(MVD)的表達(dá)均明顯低于PBS組(p

10、IL-6、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子的作用。 3、rhlL-24使SGC7901胃癌細(xì)胞出現(xiàn)G2／M阻滯，并出現(xiàn)明顯的凋亡峰，并對雞胚尿囊膜的微血管形成有明顯的抑制作用。 4、rhIL-24和pcDNA3．0-hIL-24干預(yù)治療的人胃癌裸鼠移植瘤組織中BCL-2、VEGF、CD34的表達(dá)明顯降低，BAX的表達(dá)明顯增高。 5、rhIL-24和pcDNA3．0-hIL-24對人胃癌裸鼠移植瘤的生長、腫瘤血管的