CD-5-FC聯(lián)合IL-24對(duì)肝癌細(xì)胞殺傷作用的影響及其機(jī)制的初探.pdf

1、目的：觀察CD/5-FC自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合IL-24對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2體內(nèi)外殺傷作用的影響，并初步探討其機(jī)制。
　　 方法：(1)應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將Fcy：Fur基因轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞株HepG2，經(jīng)G418篩選2周后行有限稀釋法獲得穩(wěn)定表達(dá)Fcy：Fur基因的單克隆細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)Fcy：Fur基因mRNA的表達(dá)情況，鑒定細(xì)胞模型。(2)將IL-24基因克隆入慢病毒轉(zhuǎn)移載體pHAGE-CMV-MCS-IzsGree

2、n，構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)載體pHAGE-IL-24，然后將pHAGE-IL-24、包裝質(zhì)粒psPAX2和包膜質(zhì)粒pMD2.G共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，同時(shí)包裝慢病毒空載體作陰性對(duì)照，進(jìn)而將包裝的重組慢病毒感染包裝細(xì)胞，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)及Western blot檢測(cè)IL-24蛋白表達(dá)，從而驗(yàn)證攜帶IL-24基因的重組慢病毒是否構(gòu)建成功。(3)應(yīng)用5-FC及攜帶IL-24的重組慢病毒分組處理穩(wěn)定表達(dá)Fcy：Fur

3、基因的人肝癌細(xì)胞株HepG2，采用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD/5-FC系統(tǒng)聯(lián)合IL-24對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖及凋亡的影響。(4)裸鼠皮下接種穩(wěn)定表達(dá)Fcy：Fur基因的人肝癌細(xì)胞株HepG2，建立荷瘤小鼠模型。待腫瘤長(zhǎng)至40-50mm3后，分組處理，予腹腔注射前體藥物5-FC、瘤內(nèi)注射慢病毒IL-24，隔天一次，共7次，30天后處死裸鼠，剝離腫瘤組織，HE染色觀察腫瘤組織的病理形態(tài)，免疫組化法檢測(cè)FasL表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)

4、腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。
　　 結(jié)果(1)將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN-Fcy：Fur，轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞株HepG2后，經(jīng)RT-PCR鑒定，可見(jiàn)約1227bp左右處有一特異性條帶，大小與目的基因一致。(2)將IL-24基因重組到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen載體，酶切鑒定的電泳結(jié)果顯示，pHAGE-IL-24質(zhì)粒含有650bp左右的插入基因片斷，核酸序列測(cè)定后經(jīng)Blast比對(duì)顯示，克隆的基因序列和GenBank中已登

5、記的IL-24基因序列完全一致，并獲得了高滴度的重組慢病毒IL-24(5×106TU/ml)及慢病毒空載體Mock（滴度為2.5×106TU/ml）。(3)MTT法和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：與PBS組相比，5-FC組、IL-24組、Mock+5-FC組和IL-24+5-FC組細(xì)胞均有顯著抑制生長(zhǎng)及促進(jìn)凋亡作用（P＜0.05），并隨著時(shí)間的增加，作用增強(qiáng)，IL-24+5-FC組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制及促進(jìn)凋亡作用明顯高于它各組（P＜0.05）。(4)

6、成功建立荷瘤小鼠模型，HE染色結(jié)果顯示，各治療組腫瘤細(xì)胞呈不同程度凝固性壞死，周?chē)鷱V泛纖維化，聯(lián)合治療后腫瘤細(xì)胞壞死更為嚴(yán)重，PBS組腫瘤細(xì)胞豐富，呈增殖樣生長(zhǎng)；免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，與PBS組相比，5-FC組、IL-24組、Mock+5-FC組、IL-24+5-FC組細(xì)胞FasL的表達(dá)均有顯著增高(P＜0.05)，IL-24+5-FC組FasL的表達(dá)高于其它各組(P＜0.05)；TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，與PBS組相比，5-FC組、

7、IL-24組、Mock+5-FC組、IL-24+5-FC組細(xì)胞均有顯著促凋亡作用（P＜0.05），且IL-24+5-FC組腫瘤促凋亡作用明顯高于其它各組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Fcy：Fur基因的人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞模型及攜帶IL-24基因的重組慢病毒；CD/5-FC自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合IL-24具有體內(nèi)外抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖及促凋亡的作用，且這種作用可能是通過(guò)上調(diào)FasL而介導(dǎo)的，為臨床治療