托吡酯對(duì)大鼠腦局灶性缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、背景和目的 腦卒中是目前人類疾病的三大死亡原因之一，是導(dǎo)致成人殘疾的最常見原因。腦缺血發(fā)生后，腦組織存在著復(fù)雜的病理生理過程，包括腦血流中斷及低灌注、能量耗竭、血流再通后的再灌注損傷、自由基反應(yīng)、興奮性氨基酸毒性及鈣超載等，將導(dǎo)致神經(jīng)元變性壞死，遲發(fā)性神經(jīng)元死亡和/或凋亡，而神經(jīng)保護(hù)劑的應(yīng)用可減少由缺血帶來的一系列病理損傷，是目前研究的熱點(diǎn)。 近年來的研究表明，腦缺血時(shí)γ-氨基丁酸/谷氨酸(γ-aminobutydc a

2、cid GABA，glutamate Glu)比值進(jìn)行性下降造成興奮—抑制失衡是導(dǎo)致缺血性損傷的重要原因之一，GABA是中樞內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)元損傷中與主要的興奮性遞質(zhì)谷氨酸相抗衡，介導(dǎo)GABA中樞效應(yīng)的受體至少有3種不同類型，其中GABAa受體分布最廣泛，并在缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)中占主導(dǎo)地位。在Glu的興奮性毒性中N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartat NMDA)起重要作用,NMDA受體過度

3、興奮介導(dǎo)的Ca<'2+>內(nèi)流，引起神經(jīng)細(xì)胞遲發(fā)性損傷在興奮毒性的病理中占主導(dǎo)地位。NMDARl是NMDA受體復(fù)合物的必需功能亞單位，在介導(dǎo)NMDA中樞效應(yīng)中起著重要作用。 目前，人們注意到，被廣泛應(yīng)用的抗癲癇藥具有一定的腦保護(hù)作用，其機(jī)理可能是通過減少興奮傳遞或增強(qiáng)神經(jīng)元抑制來抵消異常的腦興奮性。托吡酯(topiramateTPM)是一種具有多重藥理機(jī)制的新型抗癲癇藥物，它的作用機(jī)制包括增強(qiáng)GABA介導(dǎo)的抑制作用；阻滯Ca<'2

4、+>、Na<'+>通道，作用于非NMDA受體拮抗谷氨酸的興奮毒作用等，其在抗癲癇的使用上取得了較滿意的效果，但在缺血性腦損傷保護(hù)方面的研究尚少。研究托吡酯對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制有較重要的意義，可為其作為神經(jīng)保護(hù)劑的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。本研究通過建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，檢測(cè)再灌注后大鼠腦組織缺血區(qū)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)(GABA，Glu)含量，梗死半球的NMDARl．GABAa．受體陽性細(xì)胞表達(dá)的變化；光鏡下觀察細(xì)胞壞死情況

5、變化，同時(shí)應(yīng)用托吡酯進(jìn)行干預(yù)，探討托吡酯的神經(jīng)保護(hù)作用及作用機(jī)制，以開拓腦梗塞治療的新措施，并為以后臨床上應(yīng)用托吡酯治療腦梗塞提供理論依據(jù)。 材料方法 1．動(dòng)物分組：健康雄性SD大鼠92只，體重280～320克，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為4組：A：假手術(shù)組18只；B：?jiǎn)渭內(nèi)毖M18只； C：托吡酯治療組18只；D：托吡酯預(yù)防組18只。 2．動(dòng)物處理：模型的制作：線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈(middle c

6、erebral arteryocclusion MCAO)閉塞模型，按Kuge Y等報(bào)告的方法稍加改進(jìn)。B，C、D組大鼠制成MCAO模型假手術(shù)組除不將尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈外，余同手術(shù)組。A組：進(jìn)行假手術(shù)處理，24h時(shí)生理鹽水10ml/kg灌胃。B組：于拔線再灌注時(shí)生理鹽水10ml/kg灌胃。C組：于拔線再灌注時(shí)用新鮮配制成的TPM混懸液(10mf/ml，100mg/kg)灌胃。D組：于腦缺血再灌注術(shù)前3 d開始給藥，劑量為100 mg/k

7、g灌胃，每天一次，末次給藥30min后行腦缺血再灌注手術(shù)。 3．標(biāo)本的制作：大鼠再灌注24h后，每組大鼠隨機(jī)取出6只，斷頭，快速于冰盤上分離右側(cè)額頂葉皮層組織，稱重，按1：10加入HClO<,4>(0.4mol/L)，用組織勻漿器冰浴勻漿1.5min，冰浴沉淀30min，離心(12000轉(zhuǎn)/分，20min，4<'0>C)后，吸取上清液分裝，于-70<'0>C冰箱保存，待測(cè)GABA,Glu含量。余下的各組大鼠經(jīng)心臟灌注固定后做石蠟

8、切片，供HE染色或做免疫組化用。 4．觀察指標(biāo)： (1)缺血再灌注24h時(shí)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，按Zausinger 6分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。 (2)HE染色：光鏡下觀察腦組織的病理變化。 (3)用SP免疫組化法觀察NMDARl及GABAa的表達(dá)情況。 (4) 高效液相色譜分析儀測(cè)腦組織內(nèi)GABA，Glu的含量5．統(tǒng)計(jì)方法：應(yīng)用$PSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s

9、)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，取α=0.05作為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果1．神經(jīng)功能評(píng)分：假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺損，0分；單純?nèi)毖M神經(jīng)功能評(píng)分為2.97+0.94；托吡酯治療組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為1.98+0.76；托吡酯預(yù)防組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為1.32±0.48；單純?nèi)毖M與假手術(shù)組相比，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分有明顯差異(P<0.01)托吡酯治療組與單純?nèi)毖M相比，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分有差異(P<0.05)，托吡酯預(yù)防組與單

10、純?nèi)毖M相比，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分有明顯差異(P<0.01)。 2．HE染色：光鏡下假手術(shù)組偶有神經(jīng)元細(xì)胞變性、死亡，大部分細(xì)胞形態(tài)正常；單純?nèi)毖M可見大量神經(jīng)元細(xì)胞變性、死亡，核濃縮，空泡變性。托吡酯治療組梗死灶內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，細(xì)胞周圍明顯水腫，組織結(jié)構(gòu)疏松，死亡細(xì)胞較單純?nèi)毖M明顯減少，托吡酯預(yù)防組神經(jīng)元細(xì)胞變性、死亡現(xiàn)象較托吡酯治療組減少。 3．大鼠腦皮層組織Glu含量：假手術(shù)組86.36±7.01uM/L；單純?nèi)?/p>

11、血組105.87+20.70uM/L；托吡酯治療組75.31±9.87uM/L；托吡酯預(yù)防組63.29±7.08。大鼠腦皮層組織GABA含量：假手術(shù)組5.57+0.36 uM/L；單純?nèi)毖俟嘧⒔M8.61±1.98uM/L；托吡酯治療組11.87±2.41uM/L；托吡酯預(yù)用藥組13.91±2.29 uM/L。單純?nèi)毖M大鼠缺血區(qū)腦皮層組織中興奮性氨基酸Glu，抑制性氨基酸GABA均升高(均P<0.05)。托吡酯治療組Glu含量較單純?nèi)?/p>

12、血組降低(P<0.05)，GABA含量與單純?nèi)毖M相比增多(P<0.05)。托吡酯預(yù)防組Glu含量較單純?nèi)毖M明顯降低(P<0.01)，GABA含量與單純?nèi)毖傧啾让黠@增多(P<0.01)。 4．大鼠腦缺血側(cè)腦組織GABAa免疫陽性細(xì)胞數(shù)：假手術(shù)組58.16±1.72；單純?nèi)毖俟嘧⒔M19.67±2.80；托吡酯治療組31.50±1.38；托吡酯預(yù)用藥組38.67±1.63。單純?nèi)毖俟嘧⒔M與假手術(shù)組相比大鼠腦缺血側(cè)腦組織GAB

13、Aa明顯降低(P<0.01)，托吡酯治療組較單純?nèi)毖MGABAa增高(P<0.05)。托吡酯預(yù)防組GABAa含量較單純?nèi)毖俟嘧⒔M明顯增高(P<0.01)。大鼠腦缺血側(cè)腦組織NMDAR1免疫陽性細(xì)胞數(shù)：假手術(shù)組35.50±1.38；單純?nèi)毖俟嘧⒔M25.33±2.25；托吡酯治療組16.00±2.09;托吡酯預(yù)防組10.67±1.03，單純?nèi)毖M與假手術(shù)組相比大鼠腦缺血側(cè)腦組織NMDAR1明顯降低(P<0.01)，托吡酯治療組較單純?nèi)毖?/p>

14、組NMDARl受體量降低(P<0.05)，托吡酯預(yù)防藥組NMDAR1受體量與單純?nèi)毖俟嘧⒔M相比明顯降低(P<0.01)。 結(jié)論 1、托吡酯對(duì)大鼠的腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)和治療作用。 2、托吡酯的腦保護(hù)作用與其應(yīng)用時(shí)間有關(guān)，治療性應(yīng)用托吡酯的腦保護(hù)作用弱，預(yù)防性應(yīng)用托吡酯的腦保護(hù)作用強(qiáng)。 3、托吡酯的保護(hù)大鼠腦缺血的的重要機(jī)制之一可能是通過抑制興奮性氨基酸釋放、提高抑制性氨基酸釋放及改變其受體表達(dá)實(shí)現(xiàn)的