銅對(duì)黃顙魚和矛尾復(fù)蝦虎魚脂類代謝的影響及機(jī)理研究.pdf

1、銅是魚類必需的微量元素之一，具有多種生理功能，但同時(shí)它也是一種重金屬元素，過(guò)量會(huì)對(duì)魚類產(chǎn)生毒副作用。目前的研究主要關(guān)注銅對(duì)魚類生長(zhǎng)性能、銅富集、組織結(jié)構(gòu)病變以及氧化應(yīng)激等方面的影響，而關(guān)于銅影響魚類脂肪沉積及脂類代謝的研究報(bào)道極為缺乏。本文以矛尾復(fù)蝦虎魚和黃顙魚為研究對(duì)象，首先克隆得到了一些脂類代謝相關(guān)基因的cDNA序列，并對(duì)其做了組織表達(dá)分析。然后，我們研究了水體銅暴露和飼料銅水平（缺乏和過(guò)量）對(duì)這兩種魚脂類代謝的影響及其機(jī)理。主要結(jié)

2、果如下:
　　1.黃顙魚和矛尾復(fù)蝦虎魚脂類代謝基因的分子克隆及組織表達(dá)分析
　　利用簡(jiǎn)并引物，采用RT-PCR和RACE技術(shù)從黃顙魚中獲得了兩種激素敏感脂酶(HSL)基因的cDNA全長(zhǎng)，命名為HSL1和HSL2。其長(zhǎng)度分別為2739和2629bp，分別編碼679和813個(gè)氨基酸，同源性為57.7％。進(jìn)化分析結(jié)果表明，這兩種HSL基因?qū)倥韵低椿颍赡墚a(chǎn)生于硬骨魚類特有的基因組倍增事件。HSL1和HSL2在該魚的各組織（肝臟

3、、心臟、脾臟、腎臟、肌肉、鰓、腸道、腦和腸系膜脂肪組織）以及各發(fā)育階段（稚魚期、幼魚期、亞成魚期和成魚期）均有表達(dá)，但呈現(xiàn)出不同的組織及發(fā)育表達(dá)模式，可能意味著它們具有不同的生理功能。
　　利用簡(jiǎn)并引物和RT-PCR技術(shù)從矛尾復(fù)蝦虎魚中獲得了15個(gè)脂類代謝相關(guān)基因的cDNA片段，包括G6PD、6PGD、ME、ICDH、FAS、ACCα、ACCβ、LPL、ATGL、HSL1、HSL2、CPTⅠA、SREBP-1、PPARα和PPAR

4、γ。這些基因與人、小鼠、爪蟾及斑馬魚的氨基酸同源性為54.6％～93.1％。進(jìn)化分析進(jìn)一步確定了這些基因并證明了矛尾復(fù)蝦虎魚的進(jìn)化地位。所有這15個(gè)基因在矛尾復(fù)蝦虎魚的各組織（包括肝臟、肌肉、脾臟、腦、腸道、心臟及鰓）中均檢測(cè)到，只是表達(dá)量有所差異。
　　2.水體銅暴露對(duì)矛尾復(fù)蝦虎魚生長(zhǎng)、銅富集及肝臟脂類代謝的影響
　　為了研究水體銅暴露對(duì)矛尾復(fù)蝦虎魚生長(zhǎng)、銅富集及脂類代謝的影響，將矛尾復(fù)蝦虎魚分別暴露于3個(gè)銅濃度(對(duì)照、5

5、7μg Cu/L和118μg Cu/L)的水體中30d。結(jié)果顯示，隨著水體銅濃度的上升，矛尾復(fù)蝦虎魚生長(zhǎng)性能下降，但肝體比(HSI)、臟體比(VSI)和肝臟脂肪含量均升高。油紅O染色結(jié)果顯示，銅暴露組魚的肝臟呈現(xiàn)大量的脂肪變性。銅暴露增加了肝臟6PGD、G6PD和ME的活性，但對(duì)FAS、ICDH和CPTⅠ的活性沒(méi)有顯著影響。此外，銅暴露增加了肝臟、鰓和胃腸道的銅含量，而對(duì)肌肉和脾臟沒(méi)有顯著影響。本研究證明了水體銅暴露能增強(qiáng)矛尾復(fù)蝦虎魚的

6、脂類合成代謝，從而導(dǎo)致其肝臟脂肪沉積增加。
　　3.水體銅暴露對(duì)黃顙魚脂類代謝的影響
　　為了研究水體銅暴露對(duì)黃顙魚肝臟和脂肪組織中脂類代謝的影響及其機(jī)理，將黃顙魚分別暴露于4個(gè)銅濃度(對(duì)照、24μg Cu/L、71μg Cu/L和118μg Cu/L)的水體中6周。結(jié)果顯示，水體銅暴露對(duì)生長(zhǎng)和形態(tài)學(xué)參數(shù)（肝體比、臟體比、脂體比和肥滿度）有不利影響。在肝臟中，隨著水體銅濃度的上升，脂肪含量、脂肪生成酶（6PGD、G6PD、M

7、E、ICDH和FAS）的活性，以及6PGD、G6PD、FAS和SREBP-1基因的mRNA表達(dá)水平均降低，但LPL的活性及其mRNA表達(dá)水平升高。在脂肪組織中，水體高銅濃度下G6PD、ME和LPL的活性以及FAS、LPL和PPARγ基因的表達(dá)水平顯著下降。此外，在肝臟和脂肪組織中，轉(zhuǎn)錄因子(SREBP-1和PPARγ)與脂肪生成酶的活性及其編碼基因的mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)不同的皮爾森相關(guān)性。因此，本研究表明，銅暴露下肝臟和脂肪組織中脂肪含

8、量的降低是由于脂肪生成酶的活性及其編碼基因的表達(dá)水平下降引起的。肝臟和脂肪組織中這些酶和基因的不同反應(yīng)表明了銅暴露下魚類脂類代謝的調(diào)節(jié)具有組織特異性。
　　4.水體銅暴露對(duì)黃顙魚肉堿含量、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(CPTⅠ)的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及其表達(dá)的影響
　　為了進(jìn)一步闡明水體銅暴露影響黃顙魚脂類代謝的機(jī)理，將黃顙魚分別暴露于4個(gè)銅濃度(對(duì)照、24μg Cu/L、71μg Cu/L和118μg Cu/L)的水體中6周后，分析對(duì)肝臟和肌

9、肉組織中肉堿含量、CPTⅠ的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及四種CPTⅠ構(gòu)型表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，銅暴露增加了肝臟的最大反應(yīng)速率(Vmax)、米氏常數(shù)(Km)以及催化效率(Vmax/Km);在肌肉中，198μgCu/L組的Vmax顯著高于對(duì)照組，但Km和Vmax/Km在各處理組間沒(méi)有顯著差異。對(duì)于肉堿組成，在肝臟中，隨著水體銅濃度的上升，總?cè)鈮A(TC)和脂酰肉堿(AC)的含量以及脂酰肉堿與游離肉堿的比值(AC/FC)升高，但游離肉堿(FC)的含量沒(méi)有顯

10、著變化;在肌肉中，隨著水體銅濃度的升高，F(xiàn)C的含量下降，但AC的含量上升，從而導(dǎo)致AC/FC升高。對(duì)于CPTⅠ基因的表達(dá)，暴露于高銅濃度下(198μg Cu/L)顯著上調(diào)了肝臟中CPTⅠα1a、CPTⅠα1b、CPTⅠα2a，以及肌肉中CPTⅠα1a、CPTⅠα1b、CPTⅠβ的表達(dá)水平。此外，CPTⅠ基因的表達(dá)水平與肉堿的Km值及CPTⅠ的活性呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。因此，本研究表明，水體銅暴露通過(guò)改變?nèi)鈮A組成、CPTⅠ動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及不同CP

11、TⅠ亞型的表達(dá)水平從而影響了CPTⅠ的活性，進(jìn)而影響黃顙魚的脂類代謝和脂肪沉積。
　　5.飼料銅缺乏和過(guò)量對(duì)黃顙魚脂類代謝的影響
　　為了研究飼料銅缺乏和過(guò)量對(duì)黃顙魚肝臟、肌肉和脂肪組織脂類代謝的影響及其機(jī)理，黃顙魚分別飼喂銅含量為0.76（銅缺乏）、4.18（適量銅）和92.45（銅過(guò)量）mg/kg的飼料8周。結(jié)果顯示，適量銅組魚的增重率和特定生長(zhǎng)率顯著高于銅缺乏和銅過(guò)量組。在肝臟中，銅缺乏對(duì)銅富集和脂肪含量、脂肪生成酶(

12、6PGD、G6PD和FAS)的活性，以及6PGD、G6PD、FAS、ACCα、PPARγ、LXR、HSL、PPARα和ATGL的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響;但銅過(guò)量增加了銅富集、降低了脂肪含量、抑制了FAS的活性，并下調(diào)了6PGD、G6PD、FAS、ACCα、PPARγ、HSL和ATGL的表達(dá)水平。在肌肉中，飼料銅水平對(duì)脂肪含量、脂肪生成酶的活性及大多數(shù)檢測(cè)基因(6PGD、G6PD、FAS、SREBP-1、PPARγ、HSL和LPL)

13、的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響。在脂肪組織中，飼料銅缺乏和過(guò)量對(duì)銅富集和脂肪含量、FAS的活性，以及6PGD、G6PD、FAS、SREBP-1、LXR、PPARα和LPL的表達(dá)水平均沒(méi)有顯著影響。因此，本實(shí)驗(yàn)表明組織中脂肪含量的改變跟脂類代謝酶的活性及相關(guān)基因表達(dá)水平密切相關(guān)。飼料銅水平差異性地影響了肝臟、肌肉和脂肪組織中脂肪生成酶的活性及相關(guān)基因的表達(dá)水平，表明不同飼料銅水平下魚類脂類代謝的調(diào)節(jié)具有組織特異性。
　　6.飼料銅缺乏和過(guò)量

14、對(duì)黃顙魚肉堿含量、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(CPTⅠ)的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及其表達(dá)的影響
　　為了進(jìn)一步闡明飼料銅缺乏和過(guò)量影響黃顙魚脂類代謝的機(jī)理，黃顙魚分別投喂銅含量為0.76（銅缺乏）、4.18（適量銅）和92.45（銅過(guò)量）mg/kg的飼料8周后，分析對(duì)肝臟和肌肉組織中肉堿含量、CPTⅠ的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及四種CPTⅠ構(gòu)型表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，在肝臟中，銅缺乏對(duì)FC、TC和AC的含量及AC/FC值沒(méi)有顯著影響;但銅過(guò)量降低了FC、TC和A

15、C的含量及AC/FC值。在肌肉中，飼料銅缺乏和過(guò)量對(duì)FC、TC和AC的含量沒(méi)有顯著影響，但銅過(guò)量增加了AC/FC值。與適量銅組相比，銅缺乏對(duì)肝臟和肌肉的Vmax、Km以及Vmax/Km都沒(méi)有顯著影響;但是，銅過(guò)量組肝臟的Vmax和Vmax/Km顯著降低，而肌肉的Vmax顯著升高。飼料銅含量也影響了肝臟和肌肉中四種CPTⅠ亞型(CPTⅠα1a、 CPTⅠα1b、CPTⅠα2a和CPTⅠβ）的表達(dá)水平。此外，CPTⅠ基因的表達(dá)水平與肉堿的K