內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在銅差異性影響黃顙魚和蝦虎魚脂代謝中的作用及其機(jī)制.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是一個(gè)擔(dān)負(fù)重要生理功能的細(xì)胞器，不僅擔(dān)負(fù)著蛋白質(zhì)正常的合成折疊和運(yùn)輸，而且還承擔(dān)著甘油三酯和膽固醇的合成以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子的儲(chǔ)存。當(dāng)細(xì)胞受到體內(nèi)外的刺激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中將出現(xiàn)未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白的積聚，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生不同程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER Stress)，并激活其下游信號(hào)通路——未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。近年來(lái)，人們對(duì)ER Stress及其介導(dǎo)的信號(hào)通路的剖析已經(jīng)取得了重要進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了一些關(guān)鍵基因和蛋白，也查明了信號(hào)

2、通路;同時(shí)，最近研究也表明ER Stress及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在脂類代謝中發(fā)揮了重要作用。然而，這些研究大都是在陸生哺乳動(dòng)物開展的，有關(guān)魚類中ER Stress及其介導(dǎo)的信號(hào)通路知之甚少。
　　銅是魚類必需的微量元素之一，作為多種酶的輔助因子及一些蛋白的組成部分，廣泛參與魚體內(nèi)的生理生化過程。前期研究已經(jīng)表明銅（經(jīng)由水體和/或飼料途徑）可對(duì)魚類脂肪沉積及代謝產(chǎn)生影響。然而，目前我們實(shí)驗(yàn)室連同國(guó)際上一些其他的實(shí)驗(yàn)的工作仍局限于銅影響

3、下與魚類脂類代謝直接相關(guān)酶活性及基因表達(dá)的變化情況。對(duì)于銅元素影響脂類代謝上游調(diào)控通路的情況認(rèn)識(shí)較少?？紤]到ER Stress及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在脂類代謝中扮演重要角色，推斷ER Stress及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在銅差異性影響不同魚類脂代謝過程中同樣發(fā)揮著重要的作用。然而，迄今為止，在魚類中有關(guān)此類研究仍未見報(bào)道。本研究以黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）和蝦虎魚（Synechogobius hasta）為研究對(duì)象，

4、首先克隆得到了一些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討了ER Stress及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在銅差異性影響這兩種魚脂代謝過程中的作用及機(jī)制，主要分為以下3個(gè)部分內(nèi)容:
　　第一部分黃顙魚和蝦虎魚內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因的分子克隆及組織表達(dá)分析
　　利用簡(jiǎn)并引物，采用RACE技術(shù)分別從黃顙魚和蝦虎魚中獲得了5條ER Stress相關(guān)基因的cDNA全長(zhǎng)序列，包括葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、鈣網(wǎng)蛋白(CRT)、雙鏈

5、RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶(PERK)、跨膜蛋白激酶（IRE）-1α和真核翻譯起始因子(ATF)-6α。其中，在黃顙魚中，該5種基因全長(zhǎng)序列分別為2544 bp、1678 bp、3776 bp、3440 bp和2785 bp，分別編碼652、418、1080、1038和657個(gè)氨基酸;在蝦虎魚中，該5種基因全長(zhǎng)序列分別為2477bp、1953bp、4050 bp、4095bp和2845 bp，分別編碼652、419、1106、102

6、7和645個(gè)氨基酸。同源性分析的結(jié)果顯示，在黃顙魚中，這五種基因與斑馬魚（Danio rerio）、青鳉（Oryzias latipe）、人（Homo sapiens）及爪蟾（Xenopus tropicalis）等其他物種的氨基酸同源性為40.4％-94.9％;在蝦虎魚中，這5種ER Stress相關(guān)基因與斑馬魚（Danio rerio）、小鼠（Rattus norvegicus）、人（Homo sapiens）及爪蟾（Xenopus

7、 tropicalis）等其他物種的氨基酸同源性為41.5％-97.8％。進(jìn)化樹分析結(jié)果進(jìn)一步證明了黃顙魚和蝦虎魚的進(jìn)化地位。預(yù)測(cè)其蛋白結(jié)構(gòu)的結(jié)果表明，該5種ER Stress基因在黃顙魚和蝦虎魚中均包含如KDEL基序、信號(hào)肽序列、傳感器域和效應(yīng)者結(jié)構(gòu)域等結(jié)構(gòu)域。
　　通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，研究了黃顙魚和蝦虎魚GRP78、CRT、PERK、IRE-1α及ATF-6α在不同組織中的基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示，這5種ER Stres

8、s基因在黃顙魚和蝦虎魚所有被檢測(cè)組織中均有表達(dá)，且均在肝臟組織中有較高的表達(dá)量。
　　第二部分銅對(duì)黃顙魚和蝦虎魚內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的信號(hào)通路的影響
　　2.1.水體銅暴露對(duì)黃顙魚內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的信號(hào)通路的影響
　　本實(shí)驗(yàn)是在銅離子濃度分別為對(duì)照、30μg Cu/L和60μg Cu/L的水體中對(duì)黃顙魚進(jìn)行的暴露實(shí)驗(yàn)，并分別于28天和56天取肝臟組織進(jìn)行分析，研究水體銅暴露對(duì)黃顙魚肝臟內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)、ER Stres

9、s及其介導(dǎo)的信號(hào)通路的影響。結(jié)果顯示，在28天時(shí)，GRP78、GRP94、CRT、PERK、eIF2α、IRE-1α和XBP-1基因的mRNA表達(dá)水平有所升高。而在58天時(shí)，隨著水體銅濃度的上升，GRP78、GRP94、CRT、PERK、eIF2α、IRE-1α、XBP-1和ATF-6α基因的表達(dá)水平則有所下降，表明水體銅暴露誘導(dǎo)黃顙魚肝臟內(nèi)產(chǎn)生了ER Stress反應(yīng)，且該現(xiàn)象具有時(shí)間依賴性效應(yīng);同時(shí)，也表明水體銅暴露激活了兩條UPR

10、通路，既PERK-eIF2α和IRE1-XBP1通路。黃顙魚肝臟細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)也進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。
　　ER是細(xì)胞內(nèi)最大的鈣庫(kù)，ER Stress與鈣離子(Ca2+)有著不可分割的關(guān)系，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度失調(diào)是ER Stress眾多的表面形式之一。因此，為探究銅誘導(dǎo)黃顙魚肝細(xì)胞產(chǎn)生ER Stress所通過的細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員通路，本實(shí)驗(yàn)利用熒光探針Fluo-4/AM結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)測(cè)定了黃顙魚肝細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。結(jié)果

11、顯示，銅孵育顯著增加了肝細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度。同時(shí)，通過添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上鈣通道的特異性拮抗劑（IP3特異性抑制劑2-APB和RyR特異性抑制劑（dantrolene），結(jié)果顯示銅離子通過動(dòng)員釋放內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子，而造成細(xì)胞質(zhì)中鈣離子濃度的快速升高，表明細(xì)胞中鈣離子穩(wěn)態(tài)的失衡是銅誘導(dǎo)產(chǎn)生ER Stress反應(yīng)的重要原因。
　　2.2.飼料銅缺乏和過量對(duì)黃顙魚內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的信號(hào)通路的影響
　　為了研究飼料銅缺乏和過量對(duì)黃顙魚肝

12、臟和肌肉組織中ER Stress及其介導(dǎo)的信號(hào)通路的影響及其機(jī)理，黃顙魚分別飼喂三種不同銅水平(銅缺乏(0.76 mg/kg)、適量銅(4.18 mg/kg)和銅過量(92.45 mg/kg))的飼料8周。結(jié)果顯示，在肝臟組織中，銅過量顯著上調(diào)了GRP78、CRT、PERK、eIF2α、IRE-1α和XBP-1基因的表達(dá)水平;但銅缺乏只上調(diào)了CRT的mRNA表達(dá)水平。在肌肉組織中，銅過量顯著地上調(diào)了GRP78、CRT和XBP-1基因的表

13、達(dá)水平，而對(duì)其他基因的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響。銅缺乏對(duì)所有檢測(cè)基因的表達(dá)水平均沒有顯著影響。因此，本實(shí)驗(yàn)表明飼料銅過量可以引起黃顙魚體內(nèi)的ER Stress反應(yīng)，并激活了PERK-eIF2α和IRE1-XBP1通路，且該現(xiàn)象呈現(xiàn)組織特異性。
　　2.3.水體銅暴露對(duì)蝦虎魚內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的信號(hào)通路的影響
　　在本研究中，蝦虎魚分別暴露于對(duì)照、18μg Cu/L、38μg Cu/L和55μg Cu/L四種不同銅離子濃度的水體中

14、，并分別于30天和60天取肝臟組織進(jìn)行分析，研究水體銅暴露對(duì)蝦虎魚ER Stress及其介導(dǎo)的信號(hào)通路的影響。結(jié)果顯示，在30天時(shí)，水體銅暴露顯著提高了兩種ER Stress相關(guān)標(biāo)志物(GRP78和CRT)及UPR信號(hào)途徑中幾種關(guān)鍵基因(PERK、eIF2α、IRE-1α、XBP-1和ATF-6α)的表達(dá)量，表明水體銅暴露誘導(dǎo)蝦虎魚肝臟組織內(nèi)發(fā)生了ER Stress反應(yīng)，并進(jìn)一步激活了UPR信號(hào)通路。在60天時(shí)，GRP78、CRT、PE

15、RK、eIF2α、IRE-1α、XBP-1和ATF-6α基因的mRNA水平在18μg Cu/L和38μg Cu/L暴露組中有所上升。而在55μg Cu/L暴露組中，這些ER Stress基因的表達(dá)水平則有所下降，此結(jié)果與在30天時(shí)觀察到的結(jié)果正好相反，表明水體銅暴露在蝦虎魚肝臟內(nèi)誘導(dǎo)的ER Stress反應(yīng)及UPR信號(hào)通路的激活具有時(shí)間和濃度依賴性效應(yīng)。
　　同樣，為探究銅誘導(dǎo)蝦虎魚肝細(xì)胞產(chǎn)生ER Stress所通過的細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員

16、的通路，探究了銅孵育對(duì)蝦虎魚肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子穩(wěn)態(tài)的影響。結(jié)果表明銅孵育可以引起蝦虎魚肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的升高。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上鈣離子通路特異性抑制劑的添加，查明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的流失是銅誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中鈣離子升高的原因，同時(shí)也表明鈣離子穩(wěn)態(tài)的失衡在銅離子誘導(dǎo)的ER Stress反應(yīng)的重要原因。
　　第三部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在銅影響黃顙魚和蝦虎魚脂肪沉積及脂代謝中的作用及其機(jī)制
　　3.1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的信號(hào)通

17、路在銅影響黃顙魚脂肪沉積及SREBP-1c活化過程中的作用及部分機(jī)制
　　首先，本實(shí)驗(yàn)將黃顙魚分別暴露于三種銅濃度（對(duì)照、30μg Cu/L和60μg Cu/L）的水體中，并分別于28天和56天取肝臟組織進(jìn)行分析，研究水體銅暴露對(duì)黃顙魚肝臟脂肪沉積及SREBP-1c通路的影響。結(jié)果顯示，在28天時(shí)，隨著水體銅濃度的上升，肝臟內(nèi)脂肪含量、脂肪酸合成酶(FAS)活性，以及SREBP-1c通路相關(guān)基因（SREBP-1c、SCAP、ACC

18、α和FAS）的表達(dá)水平均有所升高。在56天時(shí)，隨著水體銅濃度的升高，肝臟脂肪含量、脂肪酸合成酶(FAS)的活性，以及SREBP-1c通路相關(guān)基因（SREBP-1c、ACCα和FAS）的表達(dá)水平均有所降低。組織切片和油紅O染色的結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)論。本研究表明了水體銅暴露可以通過活化SREBP-1c而影響進(jìn)而影響黃顙魚肝臟內(nèi)脂肪的沉積。
　　然后，為深入了解ER Stress及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在銅影響黃顙魚脂代謝過程中的作用機(jī)制

19、，我們探討了離體條件下，銅離子的單獨(dú)孵育及ER Stress抑制劑（4-苯基丁酸，4-PBA）對(duì)黃顙魚原代肝細(xì)胞ER Stress及其介導(dǎo)的信號(hào)通路的影響，以及由此對(duì)脂肪沉積及SREBP-1c通路產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示，銅離子單獨(dú)孵育的條件下，GRP78、GRP94、CRT、PERK、eIF2α、IRE-1α和XBP-1基因的表達(dá)水平均有所升高，同時(shí)，SREBP-1c通路相關(guān)基因（SREBP-1c、SCAP、ACCα和FAS）的mRNA表

20、達(dá)水平也隨之升高。相對(duì)于單獨(dú)銅孵育組，4-PBA的添加顯著降低了GRP78、GRP94、CRT、PERK、eIF2α、IRE-1α和XBP-1的mRNA水平;4-PBA也顯著降低了SREBP-1c、SCAP、ACCα和FAS的mRNA水平，進(jìn)而降低了肝臟細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)的含量。研究表明，ER Stress及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在銅影響黃顙魚脂肪沉積及SREBP-1c活化過程中發(fā)揮著重要作用。
　　3.2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的信號(hào)

21、通路在銅激活蝦虎魚SREBP-1c通路過程中的作用及部分機(jī)制
　　本研究以蝦虎魚的原代肝臟細(xì)胞為模型，探討了銅離子的單獨(dú)孵育及4-PBA的添加對(duì)肝細(xì)胞ER Stress及其介導(dǎo)的信號(hào)通路產(chǎn)生的影響，以及由此對(duì)SREBP-1c通路產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示，銅離子單獨(dú)孵育顯著上調(diào)了GRP78、CRT、PERK、eIF2α、IRE-1α、XBP-1和ATF-6α基因的表達(dá)水平;銅離子單獨(dú)孵育也上調(diào)了SREBP-1c通路相關(guān)基因（SREBP-