創(chuàng)傷弧菌消殺抗性及其菌體抗原、溶細(xì)胞毒素蛋白抗原主動(dòng)免疫的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的: 創(chuàng)傷弧菌（Vbrio vulnificus，Vv）是弧菌屬第5群細(xì)菌，根據(jù)其生化特性、流行病學(xué)模式以及宿主范圍將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個(gè)亞型，其中Ⅰ型Vv是導(dǎo)致人群創(chuàng)傷感染及原發(fā)性敗血癥的病原體。原發(fā)性創(chuàng)傷弧菌感染發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢(shì)。目前世界上大部分沿海國(guó)家都有創(chuàng)傷弧菌感染的病例報(bào)告。我國(guó)國(guó)內(nèi)1990年報(bào)道首例，隨后沿海各地區(qū)每年都有散發(fā)病例報(bào)道，其病死率一直居高不下。對(duì)本病的認(rèn)識(shí)不足，發(fā)病早期未能正確診斷，或

2、誤診為藥物超敏反應(yīng)而使用大劑量激素，是造成高病死率的主要原因。創(chuàng)傷弧菌的感染途徑有二：一是經(jīng)口感染，二是通過(guò)皮膚傷口侵入。創(chuàng)傷弧菌感染一旦出現(xiàn)敗血癥，其死亡率高達(dá)50%以上。那么，我們能否采取措施避免接觸到創(chuàng)傷弧菌呢？在不可避免接觸到創(chuàng)傷弧菌的情況下，我們能否通過(guò)機(jī)體主動(dòng)免疫的方法避免其感染乃至致病呢？為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了本課題，試圖通過(guò)體外及主動(dòng)免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)回答上述問題。 方法: 1．創(chuàng)傷弧菌的生化特性及抗性研究：

3、 1．1取新鮮培養(yǎng)的創(chuàng)傷弧菌接種于弧菌屬生化鑒定管及生化條培養(yǎng)24h后，目測(cè)或上機(jī)讀取鑒定結(jié)果。 1．2紫外線抗性：創(chuàng)傷弧菌ATCC27562、大腸桿菌ATCC25922懸液及平板在強(qiáng)度值達(dá)90μW/c㎡的紫外線照射不同時(shí)間后，培養(yǎng)并定量測(cè)試照射前后的活菌濃度，統(tǒng)計(jì)殺菌率，繪制照射前后滅活曲線（t-△lg）。 1．33種消毒劑抗性：戊二醛、過(guò)氧乙酸及乙醇以無(wú)菌去離子水1：2等比系列稀釋至1：256后作用于創(chuàng)傷弧菌，培養(yǎng)

4、24h觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，確定其對(duì)創(chuàng)傷弧菌的最小抑菌濃度（MIC）及最小殺菌濃度（MBC）；20g/L戊二醛、5g/L過(guò)氧乙酸及75%乙醇作用于創(chuàng)傷弧菌10s、20s、30s、60s、90s及120s，培養(yǎng)24h后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，確定其對(duì)創(chuàng)傷弧菌的最快殺菌時(shí)效。 2．創(chuàng)傷弧菌主動(dòng)免疫預(yù)防的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究 2．1創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素的提取、純化及鑒定 重組大腸桿菌pET-32a-vvhA/E． coliBL21（DE3

5、）恢復(fù)培養(yǎng)，行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌斑進(jìn)行PCR擴(kuò)增并瓊脂糖電泳驗(yàn)證目的基因存在。挑選陽(yáng)性克隆并以最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心收集細(xì)菌，超聲破菌，離心后上清液經(jīng)過(guò)His-Bind親和層析方法純化重組創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素（rVVC）并行SDS-PAGE電泳及Western-blot驗(yàn)證。純化后的蛋白以透析法進(jìn)行復(fù)性和濃縮。采用BCA（bicinchoninicacid）法進(jìn)行蛋白定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出蛋白濃度。 2．2創(chuàng)傷弧菌

6、主動(dòng)免疫預(yù)防的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：SPF級(jí)BALB/c小鼠54只，雌雄不拘，隨機(jī)分為創(chuàng)傷弧菌菌體抗原組（簡(jiǎn)稱菌體抗原組）、溶細(xì)胞毒素蛋白抗原組（簡(jiǎn)稱蛋白抗原組）、生理鹽水對(duì)照組（簡(jiǎn)稱對(duì)照組）各18只。 （2）抗原制備：創(chuàng)傷弧菌菌體抗原，新鮮培養(yǎng)的創(chuàng)傷弧菌以0．3%甲醛滅活24h，無(wú)菌試驗(yàn)合格后4℃保存；創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素蛋白抗原，rVVC與完全弗氏佐劑/不完全弗氏佐劑等體積乳化制成。 （3）免疫方

7、案：小鼠皮下多點(diǎn)注射，創(chuàng)傷弧菌菌體抗原組小鼠接種菌體抗原：1×108個(gè)/只/次；溶細(xì)胞毒素蛋白抗原組小鼠接種蛋白抗原50μg/只/次；生理鹽水對(duì)照組小鼠接種生理鹽水：0．2ml/只/次，0d、首次免疫14d后每10d加強(qiáng)一次。 （4）小鼠免疫學(xué)指標(biāo)：免疫接種3-6次后，每組3只小鼠取外周血行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血中淋巴細(xì)胞亞群比例；每組6只小鼠，取脾及胸腺，稱重，MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率；血清凝集試驗(yàn)及間接ELISA法檢測(cè)

8、特異性抗體及IgG效價(jià)。 （5）創(chuàng)傷弧菌攻擊試驗(yàn)：3組小鼠按上述方法免疫接種6次后，12只/組，75%酒精棉球消毒右下腹皮膚后腹腔注射新鮮培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌ATCC27562懸液，0．5ml/只，細(xì)菌濃度約為107-108cfu/ml。監(jiān)測(cè)所有小鼠一般情況，包括呼吸、精神狀態(tài)、毛發(fā)、體溫等。小鼠死亡后立即解剖，存活小鼠于注射活菌后48h或10d斷椎法處死，取其主要臟器及組織固定、石蠟包埋后按常規(guī)方法制片、HE染色，光鏡下觀察其病理變化

9、。同時(shí)取心臟內(nèi)血液或血凝塊進(jìn)行Vv分離培養(yǎng)及生化鑒定。 結(jié)論: 1．創(chuàng)傷弧菌ATCC27562對(duì)紫外線敏感，屬紫外線低度抗性菌；90 uW/c㎡的紫外線能有效滅殺創(chuàng)傷弧菌ATCC27562，20g/L戊二醛、5g/L過(guò)氧乙酸、75%乙醇能將其迅速有效滅活。 2．創(chuàng)傷弧菌菌體抗原、創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素蛋白抗原能有效刺激、增強(qiáng)BALB/c小鼠特異性體液免疫功能，產(chǎn)生創(chuàng)傷弧菌菌體抗體及創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素蛋白抗體，使小鼠獲