人胰腺癌組織APRIL蛋白檢測及靶向APRIL基因小干擾RNA制備.pdf

1、一、人胰腺癌組織增殖誘導(dǎo)配體蛋白表達檢測 目的：本研究擬檢測胰腺癌組織APRIL蛋白的表達情況，并同正常人胰腺組織比較，分析其表達率與胰腺癌生物學行為的關(guān)系，旨在為胰腺癌的早期診斷和預(yù)后判斷尋找新的腫瘤標志物。 方法：利用免疫組化EnVision兩步法檢測20例人胰腺癌組織APRIL蛋白的表達情況，并與正常人胰腺組織(10例)APRIL蛋白的表達情況進行對比。 結(jié)果：胰腺癌組織中APRIL陽性率為90.0％(18

2、/20)。不同組織學類型APRIL蛋白表達相類似。10例正常人胰腺組織APRIL染色反應(yīng)全部陰性(O/lO)；胰腺癌組織APRIL蛋白表達與胰腺癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、病灶大小無關(guān)。 結(jié)論：APRIL在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起一定作用，可能為胰腺癌的早期診斷和治療提供新的分子靶點。 二、APRIL高表達胰腺癌細胞株篩選 目的：篩選出增殖誘導(dǎo)配體(APRIL)mRNA高水平表達的人胰腺癌細胞株，為進一

3、步應(yīng)用RNA干擾技術(shù)治療胰腺癌研究，探討APRIL基因在胰腺癌以及其他腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過程中的作用機制奠定基礎(chǔ)。 方法：選擇3株人胰腺癌細胞(PANC-l、CFPAC-1、BXPC-3)培養(yǎng)提取mRNA后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作PCR模板。在APRIL基因高保守區(qū)設(shè)計了特異性的引物，PCR擴增目的片段，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)mRNA為內(nèi)參，通過計算機圖像掃描系統(tǒng)檢測獲得各細胞株APRIL表達量的相對值，根據(jù)該值確定3

4、株人腫瘤細胞APRIL表達的高低。 結(jié)果：根據(jù)得到的3株細胞APRIL的相對值(PANC.1：0.45；CFPAC-1：1；BXPC-3:0.57)，3株細胞中APRIL表達量高低順序是：CFPAC-1>BXPC-3>PANC.1。 結(jié)論：通過該法檢測到在不同腫瘤細胞株中APRIL的表達水平差異，提示APRIL基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起一定作用。 目的：為了特異性地沉默APRIL基因高表達人胰腺癌細胞株CFPA

5、C-1中該基因的表達，制備靶向APRIL基因的小干擾RNA(anti-APRIL-siRNA)。 方法：構(gòu)建靶向APRIL的dsRNA表達質(zhì)粒pET-22b-APRIL，在大腸桿菌中發(fā)酵表達dsRNA，利用CF-11樹脂親和層析純化得到大腸桿菌發(fā)酵表達的dsRNA；用大腸桿菌Ⅲ型RNA水解酶(RnaseⅢ)水解dsRNA；再用DEAE樹脂離子交換層析使RnaseⅢ與核苷酸分離，分子篩層析分離純化出21bp的anti-APRIL-

6、siRNA。 結(jié)果：靶向APRIL的dsRNA表達質(zhì)粒在大腸桿菌中由IPTG誘導(dǎo)表達出的dsRNA經(jīng)CF-11樹脂純化得到；dsRNA用RnaseⅢ水解后過DEAE樹脂離子交換層析和分子篩層析分離純化，15％PAGE、12％SDS-PAGE電泳證實RNaseⅢ與核苷酸分離，并純化得到21bp大小的anti-APRIL-siRNA。 結(jié)論：利用體外轉(zhuǎn)錄法我們制備出了靶向CFPAC-1細胞株的anti-APRIL-siRNA