蟬花中多球殼菌素類長鏈堿的測定方法學研究及代謝輪廓分析.pdf

1、蟬花(Cordyceps cicadae)是我國傳統(tǒng)的一種名貴中藥材，與冬蟲夏草同屬蟲菌復合體，且具有相近的藥用價值，所以醫(yī)家常將蟬花作為冬蟲夏草的代用品。蟬花的主要活性成分之一是多球殼菌素(myriocin，ISP-1)，多球殼菌素除具有較強的免疫抑制活性，還具有抗動脈粥樣硬化、抗真菌等藥理作用。
　　 ISP-1在野生和人工蟬花藥材的含量很低，這也是產(chǎn)業(yè)化的瓶頸。目前人們以期通過蟬花發(fā)酵的方法提高其產(chǎn)量。因此，建立多球殼菌素

2、類長鏈堿的檢測和評價方法并優(yōu)化蟬花菌發(fā)酵生產(chǎn)多球殼菌素具有十分重要的現(xiàn)實意義。本論文以蟬花為研究對象，建立了一套多球殼菌素分析技術(shù)平臺；建立了同時測定蟬花中四種多球殼菌素類長鏈堿(myriocin-like long-chain bases，MLB)的方法；對蟬花鞘氨醇類長鏈堿(sphingoid long-chain bases，SLB)進行了代謝輪廓分析。主要內(nèi)容及結(jié)論如下：
　　 1、蟬花中多球殼菌素含量低、成分復雜，檢測

3、困難。本論文選擇固相萃取(solidphase extract，SPE)進行樣品的純化，考察了萃取小柱種類、上樣量、洗脫和解析溶劑等因素對ISP-1凈化的影響。建立了SPE-HPLC分析蟬花多球殼菌素方法，結(jié)果表明該方法簡便易行、重現(xiàn)性好，可用于蟬花中ISP-1含量的測定，其中ISP-1的平均回收率為98.95％，RSD為2.22％。同時運用質(zhì)譜驗證了樣品中的目標成分與多球殼菌素一致性，并根據(jù)碎片荷質(zhì)比(m/z)推測了ISP-1分子離子

4、的合理裂解方式。
　　 2、由于ISP-1沒有特征吸收基團，采用紫外檢測器檢測，選擇性和靈敏度較低。為此，探索并建立了一個多球殼菌-9-氯甲酸芴甲酯(Fmoc-Cl)的反應體系，以吡啶溶解的ISP-1與四氫呋喃為溶劑的Fmoc-Cl在40℃反應10 min為優(yōu)化的反應條件。運用MS技術(shù)對Fmoc-Cl與ISP-1的衍生物的結(jié)構(gòu)進行了分析，推斷出ISP-1與Fmoc-Cl發(fā)生衍生化反應同時ISP-1的分子內(nèi)發(fā)生了內(nèi)酯化反應?？疾炝?/p>

5、衍生劑的濃度、反應溫度、反應時間等因素對ISP-1衍生物形成的影響及多球殼菌素衍生物的穩(wěn)定性。以Fmoc-Cl為衍生化試劑，構(gòu)建了一個多球殼菌素柱前衍生并采用紫外檢測的HPLC分析系統(tǒng)。定量限和檢測限分別為0.102μg/mL、0.045μg/mL，線性范圍為2.0～500.0μg/mL。采用此方法對天然和人工蟬花中多球殼菌素進行了分析，結(jié)果顯示天然蟬花中多球殼菌素的含量遠遠低于人工蟬花。
　　 3、ISP-1與鞘氨醇(sphi

6、ngosine，So)、植物鞘氨醇(phytosphingosine，Phy)和二氫鞘氨醇(sphinganine，Sa)均屬MLB，具有重要的生理作用。為此，建立了鄰苯二甲醛(o-phthalic aldehyde，OPA)柱前衍生-HPLC-UV同時分析這四種MLB的方法。采用LC-MS技術(shù)分析了ISP-1、Phy、So和Sa衍生物的結(jié)構(gòu)，并推測其質(zhì)譜裂解途徑?？疾炝搜苌磻w系中緩沖鹽濃度和pH、OPA量、2-巰基乙醇量、衍生反

7、應時間、衍生反應溫度等因素對四種MLB衍生物形成的影響及穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)控制反應溫度，2-巰基乙醇能夠選擇性參與鄰苯二甲醛與ISP-1的反應。該方法檢測性能指標為：檢出限分別為1.7、1.2、1.4和0.9μg/mL；加樣回收率都大于96％；日內(nèi)和日間精密度的RSD小于4.0％。優(yōu)化的樣品水解條件為：水解溫度110℃、水解時間16 h、溶劑量4 mL。采用此方法對6種不同碳源的蟬花樣品中四種MLB進行了分析，結(jié)果顯示平均含量最高的ISP

8、-1、So、Sa都分布在蔗糖組(340.19μg/g，124.02μg/g，387.84μg/g)，而Phy在麥芽糖組(407.78μg/g)。
　　 4、為了闡明蟬花中ISP-1與SLB相關性，利用OPA柱前衍生-HPLC-UV-MS技術(shù)，開展蟬花SLB代謝輪廓分析。精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性等3項試驗里10個色譜峰的保留時間和峰面積的RSD分別低于1.7％和4.5％。獲取24個菌絲體樣品的峰面積，經(jīng)主成分分析模式識別，提取了2個