用大腸桿菌表達速效人胰島類似物的研究.pdf

1、糖尿病(diabetes)是嚴重威脅人類健康的一類慢性代謝性疾病。胰島素(insulin)是糖尿病臨床治療不可替代的藥物,重組人胰島素類似物在糖尿病治療中的顯著優(yōu)勢使之在臨床得到廣泛應用,特別是速效胰島素類似物以其起效快和藥效達峰時間短;可以很好地改善糖尿病患者對注射胰島素藥物的依從性;避免下餐前或黎明低血糖癥發(fā)生幾率而倍受糖尿病患者青睞,市場需求量大。不過,目前在臨床應用的速效胰島素藥物僅有門冬胰島素和賴脯胰島素等幾種,因而有必要開發(fā)

2、新型速效胰島素類似物和生產新途徑。近年來,利用植物系統(tǒng)表達藥用蛋白在降低生產成本、規(guī)?；a和安全性方面與傳統(tǒng)的大腸桿菌、酵母和轉基因動物表達系統(tǒng)相比具有優(yōu)勢。
　　基于此,本研究根據人胰島素氨基酸(GenBank. AAA59172)序列和小C肽(TYPGDVPK)序列,按植物(油菜)偏愛密碼子設計合成了198 bp編碼普通人胰島素原基因Des30。隨后以Des30為模板,用PCR突變技術擴增并創(chuàng)造了基因B26H、B28D和B2

3、6H-B28D,并構建了4個原核表達載體: pET28a-Des30、pET28a-B26H、pET28a-B28D和pET28a-B26H-B28D。轉化大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)后,經IPTG誘導、用Ni-NTA親和柱純化、復性、胰島素體外成熟(酶解)和動物實驗驗證功能。取得了如下研究結果:1.基因設計合成與原核表達載體構建:根據植物偏愛密碼子的原則設計并合成198 bp的普通人胰島素原基因Des

4、30,用PCR突變技術獲得基因B26H、B28D和B26H-B28D;將目的基因插入載體pET28a相應位點,成功構建原核表達載體pET28a-Des30、pET28a-B26H、pET28a-B28D和pET28a-B26H-B28D;2.胰島素原類似物的誘導表達和純化:用終濃度1 mM的IPTG誘導,4種胰島素原類似物均成功地在大腸桿菌BL21(DE3)中表達,并以包涵體形式存在;并用Ni-NTA純化介質對目標蛋白進行純化;3.胰島

5、素原類似物的復性與酶切:純化的包涵體蛋白通過低溫透析復性,然后用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切,Western-blot結果顯示,釋放出的單體胰島素與陽性對照一樣具有免疫活性,MALDI-TOF質譜檢測結果表明,酶切產物分子量分別與預測的人胰島素類似物分子量一致。4.生物學活性檢測:小鼠血糖實驗數據表明,用大腸桿菌系統(tǒng)表達的B26H-insulin、B28D-insulin和B26H-B28D-insulin與臨床常用的速效胰島素NovoRap