細(xì)胞治療生長板損傷的研究.pdf

1、第一部分兔髂嵴軟骨細(xì)胞分離及提純的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：建立一種簡單可靠的軟骨細(xì)胞體外分離和純化的方法。
　　方法：將2只幼齡新西蘭兔心臟空氣栓塞處死后,無菌操作下取得髂嵴部位的軟骨塊,修剪成1~2mm2組織塊,經(jīng)0.1％透明質(zhì)酸酶、0.25%胰蛋白酶和0.1%II型膠原蛋白酶三步法消化濾過后獲得軟骨細(xì)胞懸液,再經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測活細(xì)胞存活率后,接種到含10%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶

2、中進(jìn)行原代培養(yǎng)。
　　結(jié)果：取材兔髂嵴軟骨經(jīng)三步酶消化法后可獲得多量的單個(gè)軟骨細(xì)胞,具有良好的細(xì)胞活性。
　　結(jié)論：此方法是一種簡單可靠的軟骨細(xì)胞分離純化方法,可進(jìn)一步通過原代培養(yǎng)擴(kuò)增后用于軟骨或生長板損傷修復(fù)的各種基礎(chǔ)研究。
　　第二部分兔髂嵴軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：建立一種簡便可靠的軟骨細(xì)胞體外原代培養(yǎng)的方法。
　　方法：將2只幼齡新西蘭兔心臟空氣栓塞處死后,無菌操作下取得髂嵴部位的

3、軟骨塊,修剪成1~2mm2組織塊,經(jīng)0.1%透明質(zhì)酸酶、0.25%胰蛋白酶和0.1%II型膠原蛋白酶三步法消化濾過后獲得軟骨細(xì)胞懸液,接種到含10%FBS細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板中進(jìn)行原代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞生長狀態(tài),軟骨細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制生長曲線,甲苯胺藍(lán)染色、II型膠原免疫組織化學(xué)染色和透射電鏡觀察鑒定培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞。
　　結(jié)果：軟骨細(xì)胞接種后24h基本貼壁生長,向四周伸出偽足,呈梭形、三角形或多角形。培養(yǎng)第3~5

4、天增殖活躍,呈細(xì)胞島樣結(jié)構(gòu),培養(yǎng)第7天增殖漸停滯,呈結(jié)節(jié)狀的鋪路石樣外觀。甲苯胺藍(lán)染色,細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色,伴深藍(lán)色顆粒,長期培養(yǎng)細(xì)胞漿嚴(yán)重空泡化,胞漿體積增大,越接近結(jié)節(jié)中間越明顯;II型膠原免疫組織化學(xué)染色,細(xì)胞漿呈淡棕色,伴棕色顆粒;透射電鏡下觀察,核大居中,細(xì)胞漿內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富,部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。
　　結(jié)論：此方法是一種簡便可靠的軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)方法,培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞具有良好的細(xì)胞活性和穩(wěn)定的特征性生物表型,可進(jìn)一步用于自體移

5、植重塑修復(fù)軟骨或生長板損傷的實(shí)驗(yàn)研究。
　　第三部分兔脛骨近端生長板損傷模型構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：建立一種簡單可靠的動(dòng)物生長板損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆椒ā?br>　　方法：將1只幼齡新西蘭兔腹腔麻醉后,無菌操作下用針頭刺入破壞雙側(cè)脛骨近端生長板。陰性對(duì)照組未行手術(shù)操作。放射學(xué)觀察生長板損傷和修復(fù)情況。
　　結(jié)果：術(shù)后1周,手術(shù)組雙側(cè)脛骨近端生長板部位呈斑片狀模糊樣影,為局部炎癥表現(xiàn);術(shù)后6周,手術(shù)組雙側(cè)脛骨近端生長板中央部