前B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子在大鼠急性呼吸窘迫綜合征中的作用研究.pdf

1、背景:ARDS是ICU中的常見病和多發(fā)病，各種因素如肺部感染、膿毒血癥、重癥急性胰腺炎、創(chuàng)傷、輸血等均可導(dǎo)致ARDS的發(fā)生，是機(jī)體過度炎癥反應(yīng)在肺部的表現(xiàn)。隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，ARDS的發(fā)生率和死亡率較以前明顯降低，但形式仍不容樂觀，因此，ARDS發(fā)病機(jī)制和治療手段研究成為眾多學(xué)者們關(guān)注的熱點(diǎn)，現(xiàn)有研究也顯示ARDS的發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜，涉及眾多的信號通路及細(xì)胞因子。
　　前B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子(Pre-B-Cell Colony

2、 Enhancing Factor)，又稱為內(nèi)脂素(visfatin)，或煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Nampt)，是近年來發(fā)現(xiàn)的主要由成熟脂肪細(xì)胞和激活的炎癥細(xì)胞分泌，全身多個器官均可表達(dá)的炎癥因子。目前有體外細(xì)胞實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)炎癥刺激可以使肺泡上皮細(xì)胞、肺微動脈內(nèi)皮細(xì)胞等大量表達(dá)PBEF，而減少PBEF的表達(dá)則可減輕上述細(xì)胞由炎癥刺激引起的相關(guān)損害，這表明PBEF可能涉及包括肺微血管損傷、肺泡上皮細(xì)胞損傷、通透性增加等在內(nèi)有關(guān)ARDS的多個

3、病理生理過程，同時也有學(xué)者通過對犬類、鼠類的不同ARDS模型進(jìn)行研究后認(rèn)為PBEF是ARDS的潛在生物標(biāo)志，因此PBEF可能成為研究ARDS的發(fā)病機(jī)制和治療ARDS的新靶點(diǎn)。
　　目的:以油酸尾靜脈注射法建立大鼠ARDS模型，并行藥物干預(yù)，觀察前B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子對ARDS大鼠肺組織病理學(xué)評分、濕干重比及動脈血氧分壓的影響;對ARDS大鼠肺泡灌洗液中TNF-α及IL-1β含量的影響;對ARDS大鼠肺組織TNF-α、IL-1β mR

4、NA和ICAM-1、VCAM-1 mRNA及蛋白表達(dá)以及NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響;通過肺組織病理學(xué)評分、濕干重比、炎癥因子及粘附因子表達(dá)及肺泡灌洗液中炎癥因子含量的變化，結(jié)合已有的體外實(shí)驗所觀察到的現(xiàn)象，試圖證實(shí)前B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子在ARDS中的作用，為進(jìn)一步研究ARDS的發(fā)病機(jī)制和病理生理過程以及治療措施提供新的思路和依據(jù)。
　　方法:40只成年健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(214±26)g，按隨機(jī)數(shù)字法分為空白對照組（C組

5、）、模型組(OA組)、藥物干預(yù)組（D組）、溶媒對照組（S組），OA組、D組及S組大鼠以油酸尾靜脈注射法復(fù)制ARDS模型，劑量為0.15ml/kg，D組及S組大鼠于造模前24小時、12小時及半小時腹腔內(nèi)注射藥物，D組以10mg/kg腹腔內(nèi)注射PBEF抑制劑FK866，S組注射FK866等體積溶媒二甲亞砜。通過觀察大鼠呼吸頻率、皮膚及口唇顏色和活動能力等初步判定造模是否成功。造模成功6小時后以3.5％水合氯醛以10ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，

6、麻醉成功后先分離出氣管，剖腹從腹主動脈處抽動脈血行血?dú)夥治鰴z測氧分壓(mmHg)，開胸觀察肺組織顏色及形態(tài)，結(jié)扎右肺門，行氣管切開置入導(dǎo)管后行左肺肺泡灌洗術(shù)，并收集肺泡灌洗液，離心取上清液備用，測定炎癥因子TNF-α、IL-1β含量（ng/L）;收集完畢后取材，右肺上葉立即固定于福爾馬林中，行病理學(xué)、免疫組化檢測，右肺中葉行濕干重比檢測，右肺下葉立即凍存于-80℃冰箱或者液氮中備用，一部分以RT-PCR及RT-qPCR方法檢測炎癥因子T

7、NF-α、IL-1β及粘附因子ICAM-1、VCAM-1 mRNA的表達(dá)，另一部分以Western Blot方法檢測NF-κB p65蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.行為學(xué)及外表觀察C組大鼠一般情況好，較為活潑，無毛發(fā)豎立等現(xiàn)象，口唇及皮膚呈現(xiàn)粉紅色，無呼吸困難;OA組、D組及S組大鼠造模后短時間內(nèi)即出現(xiàn)口唇及皮膚紫紺，全身毛發(fā)豎立，活動減少，呼吸頻率顯著增加，與C組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.001):OA組與S組呼

8、吸頻率最高，但兩者比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，D組呼吸頻率較OA組與S組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均p＜0.05），各組均無死亡。
　　2.動脈血氧分壓C組大鼠動脈血氧分壓為(103.2±11.2)mmHg，與其他各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均p＜0.001），D組動脈血氧分壓為(73.8±6.8)mmHg，與OA組及S組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，OA組動脈血氧分壓為(59.6±6.7) mmHg，S組動脈血氧分

9、壓為(59.8±11.0)mmHg，OA組及S組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。
　　3.市組織病理學(xué)及濕干重比C組大鼠肺組織在肉眼下觀察呈粉紅色，未見明顯充血、出血及腫脹，光鏡下觀察為正常肺組織結(jié)構(gòu);OA組大鼠肺組織在肉眼觀察下呈暗紅色、腫脹，可見明顯出血、充血，光鏡下可見肺組織為典型的ARDS病理學(xué)表現(xiàn);D組大鼠肺組織肉眼觀察仍可見腫脹及充血、出血，但程度較OA組輕，光鏡下可見肺組織仍有與OA組相同的病理改變，但受損面積

10、明顯減小;S組大鼠肺組織肉眼觀與顯微鏡觀察結(jié)果與OA組類似。而C組濕干重比為4.174±0.311，與其他各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均p＜0.001），D組濕干重比為5.855±0.200，與OA組及S組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，OA組濕干重比為6.527±0.239，S組濕干重比為6.664±0.324，OA組及S組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。
　　4.免疫組化法檢測肺組織PBEF、ICAM-1、VCAM-

11、1蛋白相對表達(dá)量免疫組化檢測可在所有ARDS大鼠肺組織的支氣管粘膜上皮、血管內(nèi)皮、肺泡壁及肺泡水腫液中發(fā)現(xiàn)PBEF蛋白表達(dá)。與C組比較，OA組、S組PBEF、ICAM-1、VCAM-1蛋白相對表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均p＜0.001），而D組各指標(biāo)蛋白相對表達(dá)量較OA組及S組有所減少，但較C組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均p＜0.05）。
　　5.肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α及IL-1β含量C組大鼠炎癥因子含量均較其他組低，

12、兩者分別與其他各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.001)，OA組與S組BALF中炎癥因子含量最多，但OA組及S組比較兩者差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。D組各炎癥因子含量較OA組及S組低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　6.RT-PCR法半定量及RT-qPCR法定量檢測肺組織PBEF、TNF-α、IL-1β、ICAM-1及VCAM-1mRNA表達(dá)水平RT-PCR法半定量檢測各指標(biāo)結(jié)果顯示，C組各指標(biāo)mR

13、NA相對表達(dá)量最低，較其他各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.001或p＜0.05)，D組各指標(biāo)mRNA相對表達(dá)量較OA組及S組低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.001)，OA組及S組各指標(biāo)mRNA相對表達(dá)量最高，但兩者相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，RT-qPCR法檢測結(jié)果與RT-PCR法檢測結(jié)果所得出結(jié)果類似。
　　7.Western Blot法半定量檢測肺組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平Western Bl

14、ot法半定量檢測各指標(biāo)結(jié)果顯示，C組NF-κB p65相對表達(dá)量最低，較其他各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均p＜0.001），D組相對表達(dá)量較OA組及S組低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.001)，OA組及S組相對表達(dá)量最高，但兩者相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、PBEF能促進(jìn)ARDS大鼠肺組織炎癥因子TNF-α及IL-1β的表達(dá)和生成;
　　2、PBEF能促進(jìn)ARDS大鼠肺組織粘附分