8-iso-PGF2α和p22phox C242T基因多態(tài)性與2型糖尿病大血管病變的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:2型糖尿病(type2diabetesmellitus，T2DM)常見的慢性并發(fā)癥是大血管病變，以病變重，死亡率高為特點，動脈粥樣硬化(arteriosclerosis，AS)是其典型的病理改變。近年研究表明，NADPH氧化酶來源的ROS與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其基因已成為研究AS的候選基因。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶亞單位p22phox的編碼基因CYBA的第242位上C→T突變影響自由基的產(chǎn)生，被證實是有意義突變。8-

2、異前列腺素F2α（8-isoprostaglandinF2α，8-iso-PGF2α）屬于異構(gòu)前列腺素家族成員，它其在人體中的含量穩(wěn)定并且靈敏性高，是測量體內(nèi)氧化應(yīng)激強度的最佳指標。因此本次研究的目的是①通過檢測T2DM患者血清中氧化應(yīng)激產(chǎn)物8-iso-PGF2α的水平，以明確NADPH氧化酶在T2DM大血管病變發(fā)生中所起的作用。②確定T2DM患者的基因型，以進一步了解NADPH氧化酶p22phoxC242T基因多態(tài)性與DM大血管病變的

3、關(guān)系，從而為DM大血管病變的病理機制提供分子學(xué)依據(jù)。
　　方法:按1999年WHO提出的T2DM診斷和分型標準，隨機選擇無血緣關(guān)系的T2DM患者共215例，按有無大血管病變分為單純T2DM組110例，其中男61例，女49例，年齡54.4±9.0歲，病程6.9±1.3年;T2DM大血管病變組105例，其中男60例，女45例，年齡55.9±10.4歲，病程7.00±1.2年。正常對照組:為同期我院醫(yī)務(wù)人員及常規(guī)體檢人群中健康個體100

4、例，其中男63例，女37例，年齡52.8±11.4歲，無心、腦、肝、腎臟病史。實驗者禁食12h，然后空腹抽取靜脈血3ml，先用乙二胺乙酸抗凝，用于抽取基因組DNA;再抽取4ml靜脈血，分離血清，用于生化指標和8-iso-PGF2α的檢測，二者均保存在-20℃以下.
　　1)臨床指標的測定:①測定身高、體重、腰圍和臀圍，計算體質(zhì)量指數(shù)=體重/身高2和腰/臀=腰圍/臀圍;②應(yīng)用全自動生化分析儀測定血糖、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白膽

5、固醇及高密度脂蛋白膽固醇;③用免疫比濁法和放射免疫法分別測定糖化血紅蛋白、空腹胰島素，計算胰島素敏感指數(shù)=1/（空腹胰島素×空腹血糖）。
　　2)酶聯(lián)免疫吸附法測定8-iso-PGF2α的水平。
　　3)C242T多態(tài)性的檢測:①基因組DNA提取:用血液基因組DNA小量提取試劑盒提取3ml乙二胺乙酸抗凝血中外周血白細胞DNA，然后把DNA溶液放在分光光度儀上測定其濃度和純度。②聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法檢測p22

6、phox基因C242T位點多態(tài)性:進行PCR擴增得模板為外周血白細胞基因組DNA，上、下游引物序列分別是:5'-GTGAGTCTCCTCCTGCTCTGGGGT-3'、5'-GCTTGTTTCGGTCCTGGGTGTTCT-3'，25ul反應(yīng)體系中含基因組DNA2ul，上下游引物各1ul，PCRPremix12.5ul，滅菌蒸餾水8.5ml。開始在擴增儀上反應(yīng):94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min

7、，完成35個循環(huán)，最后在72℃延伸7min。然后應(yīng)用限制性內(nèi)切酶RsaⅠ進行酶切，最后把酶切產(chǎn)物放在瓊脂糖凝膠上電泳，觀察條帶的類型，判斷NADPH氧化酶p22phox亞基基因型。CC基因型可見348bp片段，TT基因型可見160bp和188bp兩個片段，CT基因型可見348bp、160bp、188bp三個片段。
　　4)統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS16.0軟件處理所有數(shù)據(jù)。計量資料進行正態(tài)性檢驗，統(tǒng)計描述用均數(shù)±標準差（(X)±s）

8、或者中位數(shù)（四分位數(shù)間距）M(Q)表示;各組基因頻率的群體代表性用Hardy-Weinberg平衡法檢驗;計量資料的組間比較用方差分析或秩和檢驗;計數(shù)比較的組間比較用X2檢驗;進行8-iso-PGF2α濃度與其他因素的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析;用Logistic回歸分析2型DM大血管病變發(fā)生的危險因素。
　　結(jié)果:①DM組與正常對照組的年齡、性別構(gòu)成比無顯著性差別，具有可比性;糖尿病兩組的BMI、WHR、SBP、DB

9、P、TG、TC、LDL-C、FBG及HbA1c顯著高于對照組(P＜0.05)，HDL-C低于對照組(P＜0.05);T2DM大血管病變組的BMI、WHR、SBP、DBP、LDL-C顯著高于單純T2DM(P＜0.05)，HDL-C、ISI低于單純T2DM組(P＜0.05)。②單純T2DM組8-iso-PGF2α水平（33.29±12.65pg/ml）較正常對照組（27.95±12.69pg/ml）明顯升高(P＜0.01)，并且大血管病變組

10、（48.89±24.34pg/ml）明顯高于正常對照組和單純T2DM組(P＜0.01)。③8-iso-PGF2α與BMI、WHR、TG、TC、LDL-C、FBG、HbA1c及血壓呈顯著正相關(guān)，與HDL-C、ISI呈顯著負相關(guān)，與年齡、性別無顯著相關(guān)性。④正常對照組、單純DM組、DM大血管病變組T等位基因頻率分別為4.50％、7.73％、15.71％，CT+TT基因型頻率分別為9％、15.45％、26.67％。比較各組間T等位基因和CT+

11、TT基因型的頻率，正常對照組與單純T2DM組無顯著性差異;在DM大血管病變組該頻率顯著高于正常對照組和單純DM組。⑤無論在正常對照組和T2DM組中，8也o-PGF2α水平都與NADPH氧化酶C242T基因多態(tài)性有關(guān):TT+CT型8-iso-PGF2α水平為63.67±20.39pg/ml，高于CC型（31.23±13.93pg/ml），二者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;與CC型相比，CT+TT型的BMI、TC、TG、HbA1c、FBG及血壓升

12、高，ISI下降。CT+TT型組大血管病變發(fā)生率為52％，高于CC型組的29％。(X2=10.06，P＜0.01)。⑥多元回歸分析顯示BMI、LDL、ISI及8-iso-PGF2α是大血管病變的獨立危險因素。
　　結(jié)論:①T2DM患者血清8-iso-PGF2α水平升高，并且是T2DM大血管病變的危險因素，表明氧化應(yīng)激在T2DM大血管病變中起重要作用。②血清8-iso-PGF2α水平與NADPH氧化酶C242T基因多態(tài)性密切相關(guān)，T等