Nox家族和ROS在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中的動態(tài)表達及特異性Nox-2和Nox-4抑制劑對其的干預(yù)研究.pdf

1、本文從以下幾部分進行論述：
　　第一部分 Nox家族和ROS在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中的動態(tài)表達情況
　　目的:
　　檢測NOX家族(Nox1、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5、Duox1和Duox2)以及ROS在短暫性大腦中動脈閉塞(MCAO)模型大鼠半影區(qū)以及對側(cè)相應(yīng)區(qū)域的腦組織中經(jīng)閉塞2h后再灌注，不同時間點的表達情況。
　　方法:
　　任選56只成年雄性SD大鼠，隨機分為以下兩個實驗組:假手

2、術(shù)組(Sham，1組)和MCAO組（7組）。利用線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型。栓塞2h后，去除魚線，制備再灌注模型(MCAO/R)，于再灌注0h、3h、6h、12h、24h以及48h時分別取出大鼠額顳底皮層腦組織做標(biāo)本，半影區(qū)(Ischemic)以及對側(cè)相應(yīng)區(qū)域(Contralateral)的腦組織樣本中NOX家族成員(Nox1、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5、Duox1和Duox2)mRNA、蛋白表達情況分別采

3、用半定量PCR法、Western Blot方法以及免疫熒光染色技術(shù)檢測其表達水平的變化;同時采用熒光分光度計檢測DCFH-DA熒光探針熒光強度法檢測其腦組織中ROS在再灌注不同時間點的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1、在MCAO模型大鼠經(jīng)閉塞2h后再灌注后，其半影區(qū)(Ischemic)腦組織中Duox1、Nox2以及Nox4-mRNA的表達較對側(cè)相應(yīng)區(qū)域(Contralateral)中相應(yīng)蛋白-mRNA的表達顯著上調(diào);而Duo

4、x2、Nox1以及Nox3-mRNA的表達在半影區(qū)(Ischemic)和對側(cè)相應(yīng)區(qū)域(Contralateral)的腦組織中均無明顯改變。
　　2、在MCAO模型大鼠經(jīng)閉塞2h后再灌注后，其半影區(qū)(Ischemic)腦組織中Duoxl、Nox2以及Nox4-蛋白的表達較對側(cè)相應(yīng)區(qū)域(Contralateral)中相應(yīng)蛋白-蛋白的表達顯著上調(diào);而Duox2、Nox1以及Nox3-蛋白的表達在半影區(qū)(Ischemic)和對側(cè)相應(yīng)區(qū)域(

5、Contralateral)的腦組織中均無明顯改變。
　　3、免疫熒光染色結(jié)果顯示，MCAO模型大鼠經(jīng)閉塞2h后再灌注3h時時，Nox2和Nox4在其半影區(qū)腦組織神經(jīng)元中的表達較對側(cè)相應(yīng)區(qū)域腦組織神經(jīng)元中的表達顯著上調(diào)。
　　4、免疫熒光染色結(jié)果顯示，MCAO模型大鼠經(jīng)閉塞2h后再灌注3h時時，Nox2和Nox4在其半影區(qū)腦組織星行膠質(zhì)細胞中的表達較對側(cè)相應(yīng)區(qū)域腦組織星行膠質(zhì)細胞中的表達亦顯著上調(diào)。
　　5、在MCAO

6、模型大鼠經(jīng)閉塞2h后再灌注后，其半影區(qū)(Ischemic)腦組織中ROS的表達水平較對側(cè)相應(yīng)區(qū)域(Contralaterai)腦組織中ROS的表達水平顯著上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1、MCAO模型大鼠經(jīng)閉塞2h后再灌注時，Nox家族成員Duox2、Nox2以及Nox4在其半影區(qū)(Ischemic)腦組織中的表達較對側(cè)相應(yīng)區(qū)域(Contralateral)腦組織表達顯著上調(diào)。
　　2、MCAO模型大鼠經(jīng)閉塞2h后再灌注3h

7、時時，Nox2和Nox4在其半影區(qū)腦組織神經(jīng)元和星行膠質(zhì)細胞中的表達較對側(cè)相應(yīng)區(qū)域腦組織神經(jīng)元和星行膠質(zhì)細胞中的表達顯著上調(diào)。
　　3、MCAO模型大鼠經(jīng)閉塞2h后再灌注時，其半影區(qū)(Ischemic)腦組織中ROS的表達水平較對側(cè)相應(yīng)區(qū)域(Contralateral)腦組織中ROS的表達水平顯著上調(diào)。
　　第二部分 特異性Nox-2和Nox-4抑制劑對大鼠腦缺血再灌注損傷模型的干預(yù)研究
　　目的:
　　探索特異

8、性Nox-2和Nox-4抑制劑對大鼠腦缺血再灌注損傷模型的干預(yù)作用。
　　方法:
　　任選32只成年雄性SD大鼠，隨機分為以下四個實驗組:假手術(shù)組(Sham，1組)和MCAO組（3組）。利用線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，其中兩組分別以特異性Nox-2抑制劑(gp91ds-tat)或特異性Nox-4抑制劑(GKT37831)預(yù)處理，同時以未經(jīng)抑制劑處理的MCAO模型作為對照組。栓塞2h后，去除魚線，制備再灌注模

9、型(MCAO/R)，于再灌注24h時取出大鼠額顳底皮層腦組織做標(biāo)本，其半影區(qū)(Ischemic)以及對側(cè)相應(yīng)區(qū)域(Contralateral)的腦組織樣本，①ROS的表達情況:采用熒光分光度計檢測DCFH-DA熒光探針熒光強度法檢測;②腦組織損傷體積比例大小:采用體積比例法進行比較;③細胞凋亡情況:采用TUNEL免疫熒光染色法進行檢測;④;⑤白蛋白(Albumin)蛋白表達水平:采用Western Blot方法進行檢測。
　　結(jié)果

10、:
　　在MCAO模型大鼠經(jīng)閉塞2h后再灌注24h時，經(jīng)Nox2抑制劑(gp91ds-tat)或Nox4抑制劑(GKT37831)處理的MCAO模型大鼠其半影區(qū)(Ischemic)腦組織中:
　　1、ROS的表達水平較未經(jīng)Nox2抑制劑(gp91 ds-tat)或Nox4抑制劑(GKT37831)處理的MCAO模型大鼠其半影區(qū)(Ischemic)腦組織中ROS的表達顯著下調(diào);
　　2、腦組織損傷體積比例較未經(jīng)Nox2抑

11、制劑(gp91 ds-tat)或Nox4抑制劑(GKT37831)處理的MCAO模型大鼠其半影區(qū)(Ischemic)腦組織損傷體積比例顯著降低;
　　3、腦組織細胞凋亡比例較未經(jīng)Nox2抑制劑(gp91 ds-tat)或Nox4抑制劑(GKT37831)處理的MCAO模型大鼠其半影區(qū)(Ischemic)腦組織細胞凋亡比例顯著降低;
　　4、腦組織白蛋白(Albumin)蛋白表達水平較未經(jīng)Nox2抑制劑(gp91 ds-tat

12、)或Nox4抑制劑(GKT37831)處理的MCAO模型大鼠其半影區(qū)(Ischemic)腦組織白蛋白(Albumin)蛋白表達水平顯著降低。
　　結(jié)論:
　　Nox2抑制劑(gp91 ds-tat)和Nox4抑制劑(GKT37831)可以顯著抑制MCAO模型大鼠缺血再灌注時其半影區(qū)(Ischemic)腦組織中ROS的表達水平、腦組織損傷體積比例、腦組織細胞凋亡比例以及腦組織白蛋白(Albumin)蛋白的上調(diào)，進而起到腦保護作