SPCT-dot-ELISA的建立及臨床診斷價(jià)值評(píng)估.pdf

1、立題依據(jù)資料表明，由于多種原因，在我國確有不少已肯定能預(yù)防的食源性寄生蟲病，如肺吸蟲病、華枝睪吸蟲病、豬(牛)帶絳蟲病、囊蟲病、裂頭蚴病、旋毛蟲病和弓形體病等，在我國部分地區(qū)的城鄉(xiāng)感染嚴(yán)重。 目前，對(duì)于此類食源性寄生蟲病的診斷技術(shù)主要包括病原學(xué)檢查、免疫學(xué)檢查和分子生物學(xué)檢查三個(gè)方面。該類疾病難以獲得病原學(xué)診斷依據(jù)，臨床極易誤診，耽誤病程，造成患者不必要的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；分子生物學(xué)的檢查技術(shù)條件要求很高，目前尚僅限于實(shí)驗(yàn)室試用階

2、段；因此，免疫學(xué)診斷成為國內(nèi)外廣大學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)，希望能夠研究開發(fā)敏感性高、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、操作簡易、反應(yīng)快速、微量準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)實(shí)用的食源性寄生蟲病診斷技術(shù)與方法。 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(dot-enzyme-linkedimmunosorbentassay，Dot-ELISA)是近年新發(fā)展的一種ELISA技術(shù)，選用對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)吸附能力的硝酸纖維素薄膜作固相載體，底物經(jīng)酶促反應(yīng)后形成有色沉淀物使薄膜著色，然后目測(cè)或用光密度掃

3、描儀定量分析，該法具有微量、快速、經(jīng)濟(jì)、方便等特點(diǎn)，可用于檢測(cè)抗體或抗原，這項(xiàng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床免疫診斷，且能獲得較好的敏感性高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)結(jié)果。 目的:鑒此，本課題旨在根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理，建立SPCT-dot-ELISA，以期獲得較理想的敏感性高、特異性強(qiáng)的寄生蟲病檢測(cè)結(jié)果，從而為臨床寄生蟲病免疫學(xué)診斷和現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1、SPCT-dot-ELISA的建立及靈敏性和特異性指標(biāo)的檢

4、測(cè)制備日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)、肺吸蟲成蟲可溶性抗原(PwA)、囊蟲抗原(CcA)、旋毛蟲蚴蟲可溶性抗原(TsA)；BCA法測(cè)定抗原含量；將四種可溶性抗原包被在同一硝酸纖維素膜；封閉液封閉；加入病原學(xué)陽性確診35份及10份陰性待檢血清置4℃冰箱過夜；0.05％PBST第一次洗滌；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的葡萄球菌A蛋白(1：500)室溫孵育2h；0.05％PBST第二次洗滌；加底物顯色。 2、對(duì)比試劑盒平行ELISA試驗(yàn)

5、 用深圳市綠瀚、深圳市博卡ELISA試劑檢測(cè)35份病原學(xué)確證陽性患者血清及陰性血清。 3、800份臨床樣品試驗(yàn) SPCT-dot-ELISA檢測(cè)800份臨床樣品，同時(shí)比較二種國內(nèi)主要生產(chǎn)ELISA試劑盒廠商ELISA試劑產(chǎn)品，進(jìn)行平行試驗(yàn)，并統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果: 1、SPCT-dot-ELISA靈敏性、特異性指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 所有質(zhì)控點(diǎn)均呈藍(lán)色，10份日本血吸蟲病患者血清在SEA點(diǎn)均呈藍(lán)色，10份

6、肺吸蟲病患者血清在PwA點(diǎn)均呈藍(lán)色，10份囊蟲病患者血清在CcA點(diǎn)均呈藍(lán)色，5份旋毛蟲病患者血清在TsA點(diǎn)均呈藍(lán)色。10份陰性對(duì)照血清顯示所有質(zhì)控點(diǎn)均呈藍(lán)色，日本血吸蟲、肺吸蟲、囊蟲和旋毛蟲各標(biāo)記點(diǎn)無顯色反應(yīng)。 2、對(duì)比試劑盒平行ELISA試驗(yàn)結(jié)果 用深圳市綠瀚、博卡ELISA試劑進(jìn)行病原學(xué)確證陽性患者血清10份日本血吸蟲病、10份肺吸蟲病、10份囊蟲病、5份旋毛蟲病的檢測(cè)：除旋毛蟲ELISA法1份綠瀚、博卡是陰性，占2

7、0％，其它均是陽性。10份陰性血清檢測(cè)結(jié)果：綠瀚試劑旋毛蟲2份弱陽性，占40％，其它均為陰性；博卡試劑血吸蟲1份陽性，占10％，旋毛蟲1份陽性，占20％，其它均為陰性。 3、800份臨床檢測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果 SPCT-dot-ELISA檢測(cè)CcA7例陽性(4例符合)、TsA15例陽性(12例符合)，SEA、PwA為陰性。綠瀚800例中88例陽性，博卡462例陽性；其中肺吸蟲中綠瀚16例陽性，博卡52例；囊蟲中綠瀚3例陽性，博

8、卡169例；旋毛蟲綠瀚35例陽性，博卡111例陽性；肝吸蟲和血吸蟲相似，綠瀚檢測(cè)陽性分別為20和21例，博卡檢測(cè)陽性123例和71例。 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)較成功的建立了SPCT-dot-ELISA，該法具有如下特點(diǎn)： 1、檢測(cè)范圍廣：能同時(shí)檢測(cè)血吸蟲病、肺吸蟲病、囊蟲病、旋毛蟲病4種寄生蟲病患者血清中的特異抗體。 2、陽性檢出率高：經(jīng)病原學(xué)確證的陽性血清采用該法陽性檢出率為100％。 3、交叉反應(yīng)率低：肺吸蟲與