2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、肝片吸蟲(chóng)是一種人獸共患寄生蟲(chóng),該寄生蟲(chóng)能夠感染包括人在內(nèi)的許多哺乳動(dòng)物。受片形吸蟲(chóng)感染的動(dòng)物臨床癥狀主要是急性或慢性肝炎和膽管炎。建立快速、方便且較為特異、靈敏的肝片吸蟲(chóng)檢測(cè)方法,對(duì)于及時(shí)診斷片形吸蟲(chóng)病、進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查以及建立片形吸蟲(chóng)病防控預(yù)警系統(tǒng)有重要作用。
  本研究建立了基于第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(its-2)基因的肝片吸蟲(chóng)普通PCR及SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化,普通PCR敏感性為

2、212 fg/μl。SYBR Green熒光定量PCR敏感性達(dá)到0.167 fg/μl,比普通PCR高3個(gè)數(shù)量級(jí),組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)在0.13%-1.06%之間,組間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)在0.15%-1.46%之間,均小于2%,說(shuō)明該方法具有良好的重復(fù)性。本研究建立的普通PCR和SYBR Green熒光定量PCR均能以肝片吸蟲(chóng)基因組為模板擴(kuò)增出目的條帶或擴(kuò)增曲線(xiàn),與微小隱孢子蟲(chóng)、羊蛔蟲(chóng)、小型艾美耳球蟲(chóng)、大腸桿菌、捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)基因組

3、無(wú)交叉反應(yīng),顯示出較好的特異性。對(duì)浙江嘉興地區(qū)羊場(chǎng)采集的共250份糞樣進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查,糞便鏡檢法共檢出陽(yáng)性樣本2份,陽(yáng)性率為0.8%。普通PCR方法檢出陽(yáng)性樣本7份,陽(yáng)性率為2.8%。熒光定量PCR檢測(cè)出陽(yáng)性樣本8份,陽(yáng)性檢出率為3.2%,經(jīng)測(cè)序,檢出的陽(yáng)性樣本與目的基因相似性在99%以上,兩種PCR方法靈敏性和特異性均較高。
  本研究還利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的羊肝片吸蟲(chóng)硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶(TPx)為診斷抗原,建立了羊

4、肝片吸蟲(chóng)感染斑點(diǎn)酶聯(lián)吸附試驗(yàn)(Dot-ELISA)檢測(cè)方法。研究顯示,重組蛋白大小約30 kDa,各組分的最適反應(yīng)條件為:抗原最適包被量為0.28μg/片,血清最佳工作濃度和工作時(shí)間分別為1∶400和30 min,酶標(biāo)二抗最佳工作濃度和工作時(shí)間分別為1∶800和45 min,血清和酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)溫度均為37℃,最適封閉液和封閉條件分別為2%BSA-TBS和37℃2 h,最佳顯色時(shí)間30 min。特異性試驗(yàn)顯示該方法與捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)、細(xì)粒

5、棘球蚴、土耳其斯坦東畢吸蟲(chóng)陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。該方法靈敏度高、重復(fù)性好。但該Dot-ELISA與大片吸蟲(chóng)是否存在交叉反應(yīng)需要進(jìn)一步的研究。運(yùn)用該方法對(duì)浙江海寧和桐鄉(xiāng)共200份羊血清樣本進(jìn)行檢測(cè),陽(yáng)性率為1.5%,提示浙江海寧和桐鄉(xiāng)對(duì)羊肝片吸蟲(chóng)感染控制較好。
  綜上所述,本研究建立的普通PCR具有較好的特異性,并首次建立了基于its-2基因的肝片吸蟲(chóng)SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)方法,本研究還應(yīng)用硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶重組蛋

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