肝臟缺血再灌注時(shí)MIP-1α和HIF-1α表達(dá)的時(shí)空相關(guān)性分析和意義探討.pdf

1、肝臟是機(jī)體最大的實(shí)質(zhì)性器官,接受25％的心臟輸出血液,具有門靜脈和肝動(dòng)脈雙重血供,供血量非常豐富。自1908年P(guān)ringle報(bào)道在肝切除術(shù)中應(yīng)用控制肝十二指腸韌帶的止血方法以來(lái),肝臟對(duì)缺血耐受的時(shí)限及肝內(nèi)不同細(xì)胞群體對(duì)缺氧的耐受性差別受到普遍關(guān)注,至今仍有較大爭(zhēng)論。肝臟缺血再灌注常見于創(chuàng)傷、休克、及多種復(fù)雜肝臟手術(shù),特別是用Pringle手法阻斷肝血流切除大的肝內(nèi)病灶和肝移植手術(shù)。在肝臟血供恢復(fù)后,肝臟受到進(jìn)一步的“打擊”,發(fā)生缺血再灌

2、注損傷(hepatic ischemical reperfusion injury,HIRI)。HIRI發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是HIRI的實(shí)質(zhì)。肝臟缺血再灌注時(shí)肝細(xì)胞發(fā)生代謝功能障礙,各種炎性因子生成,大量氧自由基生成,同時(shí)門靜脈系統(tǒng)淤血,腸粘膜屏障功能障礙。再灌注后含有毒素的門靜脈血流入肝產(chǎn)生損害作用,激活免疫細(xì)胞分泌大量炎性介質(zhì),炎性介質(zhì)反向促進(jìn)免疫細(xì)胞的激活。炎性介質(zhì)和缺氧狀態(tài)作用于肝臟細(xì)胞并可能產(chǎn)生復(fù)雜的病理生理過(guò)程。本文

3、主要通過(guò)觀察肝缺血再灌注不同時(shí)限大鼠肝臟和小腸的病理形態(tài)學(xué)變化及檢測(cè)肝臟及小腸標(biāo)本中的巨噬細(xì)胞炎性蛋白(macrophage inflamationg protein-1α,MIP-1α)、缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表達(dá)變化,探討其相關(guān)性,并對(duì)二者在肝缺血再灌注損傷發(fā)生中的意義及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 目的
　　 通過(guò)建立SD大鼠肝臟缺血-再灌注損傷模型,

4、觀察大鼠肝臟缺血45min后再灌注不同時(shí)限肝臟及小腸的病理形態(tài)學(xué)變化,免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)MIP-1α和HIF-1α在肝臟及小腸組織中的表達(dá)情況,觀察MIP-1α和HIF-1α在HIRI時(shí)表達(dá)的時(shí)空分布特點(diǎn),進(jìn)一步了解炎性損傷及氧化應(yīng)激在肝臟缺血及再灌注時(shí)對(duì)肝臟缺血所致的消化道淤血性損傷以及后者對(duì)肝臟的再灌注損傷時(shí)發(fā)揮的作用。
　　 方法
　　 1.實(shí)驗(yàn)分組成年健康SD雄性大鼠55只,隨機(jī)分為三組:正常組(n=5)、缺血

5、再灌注組(n=25)、假手術(shù)組(n=25),缺血再灌注組和假手術(shù)組又根據(jù)缺血再灌注后不同時(shí)限點(diǎn)(0h、3h、12h、24h、72 h)隨機(jī)分為5個(gè)亞組,每組5只。
　　 2.動(dòng)物模型建立術(shù)前禁食12 h,自由飲水；正常組:處死后進(jìn)腹直接取材。缺血再灌注組:術(shù)前處理同正常組,行腹腔內(nèi)注射麻醉(3％戊巴比妥鈉40mg/kg),取上腹3 cm正中切口,進(jìn)入腹腔游離并用無(wú)損傷動(dòng)脈鉗夾閉肝蒂45min后放開動(dòng)脈鉗,再灌注0h組進(jìn)腹后直接取

6、材,其余大鼠切口給予縫合,繼續(xù)飼養(yǎng),于各再灌注時(shí)限點(diǎn)(3h、12h、24h、72h)取材。假手術(shù)組:術(shù)前處理及麻醉方法同缺血再灌注組,進(jìn)入腹腔后僅游離肝蒂但不阻斷,取材方法及時(shí)限點(diǎn)同缺血再灌注組。
　　 3.觀察指標(biāo)與方法①光鏡下病理變化觀察:10％福爾馬林固定大鼠肝臟及小腸標(biāo)本(上段空腸組織長(zhǎng)約5cm),梯度酒精脫水,石蠟包埋后,常規(guī)連續(xù)切片。切片行HE常規(guī)染色。②超微病理變化觀察:肝臟及小腸電鏡標(biāo)本取材后放于3％戊二醛中固定

7、20min修塊取材,SPURR低粘度包埋劑浸透包埋聚合。組織標(biāo)本行掃描電鏡觀察。③MIP-1 α和HIF-1 α表達(dá)檢測(cè)--免疫組織化學(xué)SABC法:檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物制品公司。MIP-1 α免疫組化結(jié)果以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。HIF-1α陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為胞質(zhì)棕黃色顆粒沉著,少量核染色。每張切片取10個(gè)200倍視野運(yùn)用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)行免疫組化染色陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物定量分析,記錄陽(yáng)性單位(pos

8、itiveunit,PU),并取其平均值,以PU值表示陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)的多少。
　　 4.統(tǒng)計(jì)處理 所有計(jì)量數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,計(jì)算基本統(tǒng)計(jì)量,所有實(shí)驗(yàn)組用析因設(shè)計(jì)的方差分析比較主效應(yīng)和交互效應(yīng)后,多重比較采取LSD法進(jìn)行檢驗(yàn),P<0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雙變量相關(guān)分析(Bivariate)兩變量間相關(guān)性。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論

9、>　　 各種因?yàn)橐鸬囊欢ǔ潭鹊母闻K缺血當(dāng)再灌注期血供恢復(fù)后,肝臟細(xì)胞功能代謝障礙及組織結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)一步加重,在這一過(guò)程中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、激活釋放炎性介質(zhì)參與組織損傷。HIF-1α在多種組織缺氧應(yīng)激狀態(tài)下表達(dá),并通過(guò)調(diào)節(jié)其他細(xì)胞分子的表達(dá)而對(duì)組織細(xì)胞發(fā)揮作用。MIP-1α屬于CC趨化因子一員,肝臟Kuffer細(xì)胞可以分泌MIP-1α并引起炎性細(xì)胞的聚集,促進(jìn)組織炎性損傷。
　　 HIF-1α與目的基因結(jié)合后,調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)

10、,使細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)能力增強(qiáng),其表達(dá)增強(qiáng)可能與多種疾病的細(xì)胞凋亡損傷有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中,在正常組及假手術(shù)組大鼠肝臟及小腸組織中HIF-1α表達(dá)細(xì)微。缺血再灌注后,HIF-1α在肝臟及小腸組織均有明顯表達(dá)。HIF-1α的首先表達(dá)部位可能與肝竇間隙、微膽管、中央靜脈區(qū)組織細(xì)胞血供較差,氧濃度較低,阻斷肝血流后缺血缺氧性損傷最先累及該區(qū)域有關(guān)。而在小腸組織中,腸粘膜細(xì)胞微絨毛處的血供最差,最易引起缺血缺氧性損害,故成為HIF-1α最先表達(dá)的部位。

11、
　　 HIF-1α和MIP-1α表達(dá)的正相關(guān)性表明,HIF-1α作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子可能通過(guò)促進(jìn)MIP-1α等趨化因子的表達(dá)從而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)過(guò)程,HIF-1α可能是MIP-1α表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子。有研究表明HIF-1α可使細(xì)胞自發(fā)激活上調(diào)炎性蛋白表達(dá)而增強(qiáng)上皮炎性反應(yīng),并參與了骨髓細(xì)胞的增殖分化過(guò)程。MIP-1α等趨化因子的表達(dá)增強(qiáng)使炎性細(xì)胞向炎性損傷部位聚集,炎性細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附導(dǎo)致微血管出現(xiàn)無(wú)復(fù)流現(xiàn)象,進(jìn)一步加重組織缺氧。H

12、IF-1α與MIP-1α在小腸組織與肝臟組織中表達(dá)峰值時(shí)相及表達(dá)恢復(fù)情況的差異因?yàn)?考慮可能因?yàn)殚T靜脈系統(tǒng)淤血造成胃腸道循環(huán)系統(tǒng)微小血栓形成,在肝門開放后,胃腸道繼續(xù)存在部分缺血缺氧情況,從而影響胃腸道炎性損傷的恢復(fù)所致。
　　 本研究結(jié)果表明肝臟的缺血不僅可造成肝臟實(shí)質(zhì)性及非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞的自身?yè)p傷,而且可造成消化道的損傷。在再灌注初期,肝臟血流再通后各種途徑產(chǎn)生的氧自由基對(duì)肝細(xì)胞損傷起主要作用。在小腸組織中,隨著肝門阻斷時(shí)間延長(zhǎng)

13、,門靜脈系統(tǒng)淤血程度的增加造成消化道缺氧:小腸組織有氧代謝障礙產(chǎn)生的活性氧簇使小腸組織受損,活性氧簇通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化、促進(jìn)中性粒細(xì)胞聚集及抑制線粒體功能加速細(xì)胞能量的消耗等作用導(dǎo)致小腸粘膜細(xì)胞損傷。此外,消化道的淤血性損傷也可能是造成肝臟復(fù)流后再灌注損傷的重要因?yàn)橹?因?yàn)橄喇a(chǎn)生的氧自由基及各種炎性介質(zhì)可隨著再灌注后的門靜脈血流進(jìn)入肝臟,進(jìn)而加重肝臟的損傷；二者互為因果,造成肝臟的缺血再灌注損傷和機(jī)體整體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。