殘粒脂蛋白經(jīng)由氧化機制誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細胞衰老及其microRNA表達譜的篩選.pdf

1、背景：冠心病是人類發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一，動脈粥樣硬化是其病理基礎(chǔ)。高血壓、糖尿病、吸煙等已公認為是動脈粥樣硬化的危險因子。其中，在血脂異常致動脈粥樣硬化方面，大量的流行病學(xué)和臨床試驗對低密度脂蛋白膽固醇及高密度脂蛋白等進行了廣泛而深入的研究。
　　 殘粒脂蛋白(Remnant-like lipoproteins，RLPs)是極低密度脂蛋白和乳糜微粒的脂解產(chǎn)物，其顆粒更小，所含甘油三酯更少，而更加富含膽固醇脂和Apo-E，

2、因此理論上更具有致動脈粥樣硬化的特性。人的一天中大部分時間處于餐后狀態(tài)(>12h)，而餐后狀態(tài)與禁食狀態(tài)相比，血漿中的RLPs濃度明顯升高。有研究認為血漿RLPs-C水平是冠心病的獨立預(yù)測因子，而不依賴于非脂質(zhì)危險因子及高密度和低密度脂蛋白膽固醇的水平。進一步研究證實血漿RLPs-C水平與內(nèi)皮功能失調(diào)密切相關(guān)。RLPs-C的幾個致動脈粥樣硬化特性已經(jīng)被證實(如促進炎癥，促進泡沫細胞形成及增加氧化應(yīng)激等)，但RLPs-C與內(nèi)皮功能失調(diào)的相

3、關(guān)機制仍未完全明確。
　　 已知內(nèi)皮細胞受損或失功能，是動脈粥樣硬化的始動因素。內(nèi)皮祖細胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)可以分化為成熟內(nèi)皮細胞，是內(nèi)皮細胞再生和維持內(nèi)皮細胞層完整性的重要機制。各類致動脈粥樣硬化危險因子如ox-LDL可加速內(nèi)皮祖細胞衰老，是冠心病的預(yù)測因子之一。
　　 迄今為止，殘粒脂蛋白與內(nèi)皮祖細胞衰老機制的相關(guān)研究甚少。有待于進一步對其進行深入系統(tǒng)的研究。氧化假

4、說是動脈粥樣硬化的主要機制之一。同氧化型低密度脂蛋白一樣，RLPs是否通過氧化機制而加速EPCs衰老?有待于進一步證實。
　　 由于DNA雙鏈的半保留復(fù)制，染色體的末端的端粒進行性縮短，關(guān)鍵的端粒長度或“脫帽”導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，從而加速細胞衰老，被稱為端粒介導(dǎo)的細胞衰老途徑。端粒酶，可以把一個小重復(fù)片段“(TTAGGG)n”添加到端粒上，從而可以避免或延緩細胞發(fā)生衰老。已證實他汀，血管內(nèi)皮生長因子，HDL和雌激素可以抑制或延緩內(nèi)

5、皮祖細胞的衰老，其機制或許是通過激活PI3K/Akt信號通路，降低細胞內(nèi)外的氧化應(yīng)激，從而增加端粒酶活性。RLPs是否通過上述端粒酶機制調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細胞衰老?有待于進一步對其進行系統(tǒng)深入研究。
　　 微小RNA(microRNA，miRNA)可以通過與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)互補結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平負調(diào)節(jié)靶基因的mRNA翻譯，使相關(guān)基因“沉默”或加速相關(guān)蛋白降解而失功能。某些miRNA參與調(diào)控細胞增值和衰老，且和細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水

6、平有關(guān)。新近報道，miR-34a過表達可經(jīng)由抑制SIF-1(silent information regulator1)而加速內(nèi)皮祖細胞衰老。RLPs是否加速內(nèi)皮祖細胞衰老進而致某些miRNAs變化?是否可以預(yù)測RLPs誘導(dǎo)的衰老內(nèi)皮祖細胞相關(guān)miRNAs的有關(guān)基因?目前未見相關(guān)報道。
　　 目的：本研究利用RLPs干預(yù)人EPCs，通過檢測衰老相關(guān)指標β-半乳糖苷酶和p16INK4a證實RLPs是否加速EPCs衰老；應(yīng)用阿托伐他

7、汀(atorvastatin，Ator)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)預(yù)處理細胞后，檢測EPCs的FAK、Akt及其磷酸化，明確RLPs是否通過上述反應(yīng)氧類物質(zhì)通路加速內(nèi)皮祖細胞衰老；進一步探討上述通路與端粒酶途徑的關(guān)系；并篩選衰老相關(guān)miRNAs及預(yù)測其編碼基因。本實驗旨在通過對RLPs加速內(nèi)皮祖細胞衰老的具體分子機制進行系統(tǒng)深入的研究，為動脈粥樣硬化的產(chǎn)生和發(fā)展提供理論依據(jù)。
　　 方法

8、：
　　 1.建立高脂餐模型，抽取餐后4小時外周血并應(yīng)用低速離心、免疫親和層析、透析、超速離心及微孔過濾方法分離出RLPs。
　　 2.通過酶學(xué)方法、Brawald蛋白濃度及瓊脂糖電泳方法鑒定分離的RLPs純度。
　　 3.利用密度梯度離心分離人外周血單個核細胞，并經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)成功EPCs，細胞流式鑒定EPCs的純度。
　　 4.應(yīng)用不同濃度RLPs干預(yù)EPCs，western blot方法檢測p16I

9、NK4a蛋白水平，初步確定最佳干預(yù)濃度(RLPs，100μg protein/mL)。將EPCs分為空白對照組、RLPs干預(yù)組，阿托伐他汀預(yù)處理+RLPs干預(yù)組及超氧化物歧化酶預(yù)處理+RLPs干預(yù)組，應(yīng)用β-半乳糖苷酶化學(xué)染色檢測衰老細胞數(shù)。
　　 5.應(yīng)用免疫化學(xué)方法檢測四組細胞中nitrotyrosine生成。
　　 6.以不同濃度RLPs干預(yù)EPCs，TRAP-ELISA法檢測端粒酶活性；再次確定最佳干預(yù)濃度(RL

10、Ps，100μg protein/mL)，將細胞分為以上四組，應(yīng)用TRAP-ELISA法檢測端粒酶活性。
　　 7.western blot和免疫共沉淀(IP)方法檢測磷酸化hTERT蛋白水平，western blot檢測總hTERT、FAK、Akt及其磷酸化水平。
　　 8.微陣列(micorarray)分析空白對照組和RLPs(100μg protein/mL)誘導(dǎo)的衰老EPCs細胞組miRNAs表達，應(yīng)用real

11、time RT-PCR驗證上述篩選的miRNAs。
　　 9.應(yīng)用全部人類基因4×44K oligo microarrays芯片測定全部mRNA表達，聯(lián)合生物信息學(xué)軟件，共同匹配預(yù)測相關(guān)miRNAs的靶基因。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過超速離心、免疫親和層析、透析等方法，可以成功分離RLPs，并經(jīng)酶學(xué)及瓊脂糖電泳分析其純度較高；通過密度梯度離心及培養(yǎng)分化，可以分離培養(yǎng)純度較高的EPCs。
　　 2.RL

12、Ps濃度依賴性的增加細胞內(nèi)p16INK4a蛋白水平。與對照組比較，RLPs(100μg protein/mL)明顯增加β-半乳糖苷酶陽性細胞數(shù)(P<0.01)，阿托伐他汀(1μmol/L)和超氧化物歧化酶(50U/mL)預(yù)處理后可顯著減少RLPs組的β-半乳糖苷酶陽性細胞數(shù)(P<0.01)。
　　 3.與對照組比較，RLPs(100μg protein/mL)明顯增加細胞內(nèi)nitrotyrosine生成，阿托伐他汀(1μmol/

13、L)和超氧化物歧化酶(50U/mL)預(yù)處理后可顯著抑制RLPs組EPCs的nitrotyrosine生成。
　　 4.RLPs濃度依賴性的抑制端粒酶活性，RLPs(100μg protein/mL)顯著抑制端粒酶級聯(lián)亞單位人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)及其磷酸化蛋白表達，阿托伐他汀(1μmol/L)和超氧化物歧化酶(50U/mL)預(yù)處理可顯著改善RLPs組EPCs的端粒酶活性和hTERT蛋白表達。
　　 5.與對照組比較

14、，RLPs(100μg protein/mL)顯著抑制FAK、Akt及其磷酸化蛋白表達，同樣，阿托伐他汀(1μmol/L)和超氧化物歧化酶(50U/mL)預(yù)處理可顯著改善RLPs的上述抑制作用。
　　 6.與對照組比較，在RLPs(100μg protein/mL)誘導(dǎo)的衰老EPCs中，微陣列分析顯示16個miRNAs上調(diào)，其中miR-148b，miR-155和miR-513c顯著上調(diào)；6個miRNAs下調(diào)，其中miR-574-

15、3p顯著下調(diào)。上述結(jié)果經(jīng)real time RT-PCR量化證實miR-148b，miR-155顯著上調(diào)和miR-574-3p顯著下調(diào)。
　　 7.經(jīng)由生物信息學(xué)軟件及全部mRNA匹配分析后顯示，miR-148b和miR-155的7個衰老相關(guān)基因被確定(miR-148b：CCKBR，ACVR1，DNMT1，ITGA5，GAP43；miR-155：BACH1，F(xiàn)BXO11)。
　　 結(jié)論：
　　 1.RLPs可加速