USP11抑制TNFα介導(dǎo)的NF-κB激活途徑及其在轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌中的作用.pdf

1、正常狀態(tài)下IκBα在細(xì)胞質(zhì)中與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB結(jié)合。在上游信號(hào)的刺激下，泛素化的IκBα的降解使NF-κB得到釋放、進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵事件。然而，目前關(guān)于IκBα的去泛素化的調(diào)節(jié)機(jī)制尚無清楚認(rèn)識(shí)。
　　 轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)患者預(yù)后較差，而且對(duì)放化療不敏感。因此探索ccRCC轉(zhuǎn)移過程涉及的分子遺傳背景和主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)于ccRCC早期發(fā)現(xiàn)

2、、轉(zhuǎn)移預(yù)測、開發(fā)新的藥物治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。
　　 方法：建立USPs(Ubquitin-specific proteases，USPs)表達(dá)文庫。采用蛋白組學(xué)及報(bào)告基因分析的方法初步篩選出抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的候選去泛素化酶。通過免疫沉淀、免疫印記方法檢測內(nèi)源性或過表達(dá)候選去泛素化酶在體內(nèi)體外條件下與IκBα的物理結(jié)合及去泛素化IκBα的功能。建立持續(xù)沉默去泛素化酶的細(xì)胞株，檢測該細(xì)胞株中TNFα介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途

3、徑的激活情況，以及從mRNA及蛋白水平檢測NF-κB下游基因IL6的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況。
　　 通過本實(shí)驗(yàn)室建立的轉(zhuǎn)移性、非轉(zhuǎn)移性ccRCC細(xì)胞株(RCC05TXJ，轉(zhuǎn)移性；RCC05ZYJ，非轉(zhuǎn)移性)，采用低代數(shù)細(xì)胞通過cDNA microarray橫向?qū)Ρ确治雠c轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達(dá)基因，通過生物信息學(xué)的方法分析差異表達(dá)基因富集的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，實(shí)時(shí)熒光定量PCR縱向?qū)Ρ葯z測兩株細(xì)胞中不同時(shí)間點(diǎn)與富集的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相關(guān)分子的動(dòng)態(tài)表達(dá)

4、情況，并通過沉默USP11在非轉(zhuǎn)移性ccRCC細(xì)胞株的表達(dá)、觀察相關(guān)分子的表達(dá)改變。
　　 結(jié)果：USP11在體內(nèi)或體外均與IκBα結(jié)合在一起，它是與IκBα結(jié)合的去泛素化酶。過表達(dá)USP11可以強(qiáng)烈的抑制IκBα的泛素化程度和NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。體外重組蛋白USP11在體外條件下可以發(fā)揮去泛素化IκBα的作用。進(jìn)一步，抑制USP11的表達(dá)，可以提高TNFα介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活程度，同時(shí)提高TNFα介導(dǎo)的依賴于N

5、F-κB轉(zhuǎn)錄的IL6的基因表達(dá)。
　　 差異表達(dá)基因譜中CA9、VEGF、MMP2、LAMA4、TNF家族成員、IL成員等的上調(diào)表達(dá)反映了ccRCC自身及腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的相關(guān)特征。細(xì)胞色素P450家族成員上調(diào)表達(dá)，它在某種程度上反映了腎癌的發(fā)生發(fā)展始終與環(huán)境因素在體內(nèi)代謝過程密切有關(guān)。VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、缺氧誘導(dǎo)以及新血管形成的過程富集了表達(dá)譜芯片的差異表達(dá)基因(p＜0.05，Benjamini＜1)。RhoC在RCC05TXJ

6、細(xì)胞傳代后48小時(shí)較RCC05ZYJ細(xì)胞上調(diào)表達(dá)(p＜0.05)，反映了腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的分子遺傳背景。兩株細(xì)胞同時(shí)傳代培養(yǎng)72小時(shí)后，HIF1α表達(dá)均有不同程度的升高，但在兩株細(xì)胞之間不存在明顯差異；TNFα、IL6、VEGF、MMP2等基因在轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌RCC05TXJ較非轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌RCC05ZYJ明顯上調(diào)表達(dá)(p＜0.05)；沉默USP11在非轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌RCC05ZYJ中的表達(dá)后，TNFα、IL6、VEGF表達(dá)上調(diào)(p＜0.