多態(tài)性MICA基因同種異體移植瘤模型的建立與研究.pdf

1、引言：
　　主要組織相容復(fù)合物I類相關(guān)基因A(majorhistocompatibilitycomplexclassIchain-ralatedgeneA,MICA)是MIC基因家族的功能性基因，是參與機(jī)體免疫的重要免疫分子，具有較豐富的多態(tài)性，其編碼的蛋白作為活化性受體NKG2D的配體，與NKG2D/DAP10結(jié)合，參與移植免疫、腫瘤免疫及多種自身免疫疾病，并在免疫監(jiān)視作用及腫瘤逃逸免疫中發(fā)揮重要作用。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明MICA

2、基因由于較高的多態(tài)性與其發(fā)揮的免疫學(xué)效應(yīng)尤其是移植免疫聯(lián)系緊密，目前已發(fā)現(xiàn)68個(gè)等位基因，并且存在著廣泛的地域及人種差別。關(guān)于MICA基因多態(tài)性的研究逐漸成為對(duì)MICA基因研究的熱點(diǎn)，目前越來越多的研究證明，MICA基因存在多態(tài)性現(xiàn)象，MICA基因及其抗體在多種器官移植中參與術(shù)后移植物抗宿主反應(yīng)（GVHR）及宿主抗移植物反應(yīng)（HVGR）。目前關(guān)于MICA等位基因配型及其抗體在器官移植中產(chǎn)生的免疫學(xué)效應(yīng)國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道，我們旨在建立一套多

3、態(tài)性MICA基因同種異體移植瘤模型，在受供體HLA配型完全一致的情況下，能夠?qū)Ｒ恍苑从巢煌琈ICA等位基因及其配型在移植免疫中所起到的作用。
　　目的：
　　通過病毒轉(zhuǎn)化人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），并通過序列特異性PCR（PCR-SSP）分析，建立特定HLA及MICA基因型的B淋巴母細(xì)胞系（BLCL）。建立中國(guó)人群常見MICA等位基因的真核表達(dá)載體。應(yīng)用人源化免疫NOD/SCID鼠方案，建立可模擬體內(nèi)免疫環(huán)境的小鼠模型，

4、進(jìn)而建立多態(tài)性MICA基因同種異體移植瘤模型，為后續(xù)研究不同MICA等位基因在器官移植中所起的免疫學(xué)作用提供理論依據(jù)及試驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)包含四個(gè)部分。第一部分，制備EBV病毒上清，并通過EBV轉(zhuǎn)化人外周血單個(gè)核細(xì)胞，建立B淋巴母細(xì)胞系。第二部分，合成可用于鑒定MICA等位基因的PCR混合引物對(duì)，通過PCR-SSP分析MICA基因特異性位點(diǎn)，進(jìn)而確定試驗(yàn)對(duì)象的MICA基因型，為MICA等位基因篩選及MICA配型

5、提供試驗(yàn)依據(jù)。第三部分，同過PCR-SSP對(duì)本實(shí)驗(yàn)室常見細(xì)胞系MICA基因特異性位點(diǎn)進(jìn)行分析，預(yù)篩選出特定MICA等位基因的目的細(xì)胞系，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR獲取包含特定MICA等位基因的cDNA全長(zhǎng)片段，連接到真核表達(dá)載體，構(gòu)建特定等位基因的MICA質(zhì)粒。第四部分，通過NOD/SCID小鼠腹腔注射與移植瘤HLA及MICA相同配型的PBMC，建立人源化免疫NOD/SCID小鼠多態(tài)性MICA基因同種異體移植瘤模型。
　　結(jié)果：

6、r>　　1.建立了特定HLA及MICA基因型的B淋巴母細(xì)胞系，細(xì)胞分裂增殖良好，鏡下成團(tuán)簇狀懸浮于培養(yǎng)液，每次傳代后凍存數(shù)支于液氮中，并可復(fù)蘇及繼續(xù)傳代。
　　2.合成了可供分析中國(guó)人群9種常見MICA等位基因的PCR混合引物對(duì)，對(duì)目的DNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR-SSP試驗(yàn)，通過特異性位點(diǎn)的凝膠電泳條帶，鑒定了建系細(xì)胞系BLCL的MICA等位基因?qū)儆贛ICA*008，并完成了本實(shí)驗(yàn)室常見細(xì)胞系特定MICA基因預(yù)篩選，確定7901胃癌細(xì)胞

7、系包含目的基因MICA*008。
　　3.在MICA等位基因預(yù)篩選的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建包含MICA*008基因完整外顯子的真核表達(dá)載體pcDNA3(+)/MICA*008，轉(zhuǎn)染后成功表達(dá)由MICA*008基因所編碼的MICA膜蛋白，驗(yàn)證了應(yīng)用PCR-SSP技術(shù)對(duì)細(xì)胞系中對(duì)特定MICA等位基因預(yù)篩選及構(gòu)建質(zhì)粒的可行性。
　　4.通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)論證，人免疫源性的NOD/SCID小鼠對(duì)特定HLA及MICA基因型移植瘤組與未經(jīng)人源化免疫

8、的NOD/SCID小鼠組對(duì)比，移植物成形時(shí)間及生長(zhǎng)速度上，人源化組均慢于對(duì)照組，說明包含多態(tài)性MICA基因的移植瘤模型的建立是成功的。
　　結(jié)論：
　　本研究通過PCR-SSP的方法，鑒定了常見細(xì)胞系及BLCL的MICA基因特異性位點(diǎn)，由此建立了包含特定MICA等位基因的細(xì)胞系BLCL,建立了包含特定MICA等位基因的真和表達(dá)載體pcDNA3(+)/MICA*008。通過與建系細(xì)胞系相同個(gè)體的外周血單個(gè)核細(xì)胞免疫NOD/SC