反流對食管粘膜細(xì)胞凋亡相關(guān)因子作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)通過建立反流性食管炎（RE）動物模型（單純酸反流、混合反流）及假手術(shù)動物模型，觀察各模型組動物存活情況及食管標(biāo)本肉眼表現(xiàn)，食管標(biāo)本組織學(xué)檢測，并應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測TNF-α、Caspease-3、Survivin的表達(dá)情況。探討反流對食管下段粘膜細(xì)胞凋亡相關(guān)因子作用的研究，為臨床防治胃食管反流性疾病提供試驗(yàn)性理論依據(jù)。
　　 方法：選擇健康雄性SD大鼠200只，體重（220-280）克，隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組（

2、A組）40只，單純酸反流組（B組）80只，混合反流組（C組）80只。反流模型制備成功后，分別于術(shù)后第20、24、28、32周各組隨機(jī)選取8只大鼠分三批頸椎離斷處死，后立即取出大鼠食管組織，用蘇木素伊紅（HE）染色，光鏡下觀察各組大鼠食管粘膜上皮病理變化，采用免疫組織化學(xué)方法測定食管粘膜上皮TNF-α、Caspease3、Survivin的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，應(yīng)用

3、SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：術(shù)后B組與C組大鼠體重明顯下降，與對照組有明顯差異；術(shù)后20天，存活大鼠大部分體重恢復(fù)到術(shù)前水平，飲食、活動基本正常，體重逐漸增長，但與假手術(shù)組比較增長較慢。大鼠死亡時(shí)間多發(fā)生在術(shù)后一個(gè)月內(nèi)，死亡原因多因術(shù)后進(jìn)食傷口感染、出血、吻合口瘺、腹腔感染、肺部感染等多種原因引起。
　　 大體觀察：A組大鼠食管顏色淡紅，有光澤，粘膜光滑

4、；B組大鼠模型20周時(shí)部分大鼠出現(xiàn)食管顏色變淡白，粘膜稍粗糙，隨時(shí)間延長出現(xiàn)病變的大鼠數(shù)量增多，粘膜增厚及粗糙感亦加重；C組大鼠模型與B組大鼠模型相比：病變表現(xiàn)較同期B組大鼠明顯加重，24周時(shí)部分大鼠食管擴(kuò)張，可見粘膜層出現(xiàn)點(diǎn)狀糜爛，粘膜增厚亦明顯；28周時(shí)病變大鼠數(shù)量增多，食管粘膜明顯增厚，粘膜皺襞灰白色斑塊加重，導(dǎo)致食管粘膜凹凸不平。32周時(shí)灰白色斑塊明顯隆起，呈腦溝回狀，與食管的長軸平行。
　　 光鏡下觀察，HE染色，A組

5、大鼠食管各層結(jié)構(gòu)完整，粘膜厚薄適中，粘膜表面可見較少的角化。B組大鼠模型隨時(shí)間延長，粘膜層逐漸增厚，基底細(xì)胞層及棘細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)目增多，角化層逐漸增厚，32周時(shí)可見粘膜層表層出現(xiàn)小的糜爛；C組大鼠模型病變表現(xiàn)較同期B組大鼠明顯加重，除出現(xiàn)上述病變外，24周時(shí)部分大鼠食管局部粘膜基底細(xì)胞層明顯增生，部分粘膜組織向外呈乳頭樣突起，棘細(xì)胞層細(xì)胞層次明顯增加，出現(xiàn)顆粒層細(xì)胞增加，細(xì)胞角化現(xiàn)象逐漸明顯；隨造模時(shí)間延長，粘膜明顯增生的范圍不斷增大，從

6、食管與十二指腸及胃吻合口手術(shù)部位逐漸發(fā)展至食管中段乃至上段，乳頭樣突起亦明顯增多；與此同時(shí)，賁門部胃黏膜上皮發(fā)生腸上皮化生，杯狀細(xì)胞明顯增多。28周時(shí)部分模型大鼠食管粘膜明顯增生區(qū)向外膨出形成乳頭狀瘤，粘膜表面有大量的不完全角化；部分區(qū)域上皮角向粘膜下層插入，基底細(xì)胞增生明顯；發(fā)生不典型增生，并可見散在的單個(gè)細(xì)胞漿嗜酸性增強(qiáng)，細(xì)胞核固縮。此三者皆為食管鱗狀細(xì)胞癌的癌前病變表現(xiàn)。C組32周時(shí)上述病變進(jìn)一步加重，但仍未出現(xiàn)典型的食管鱗狀細(xì)胞

7、癌病變。
　　 免疫組化：在A組各時(shí)間點(diǎn)，TNF-α蛋白在棘細(xì)胞層可見微弱的陽性表達(dá)。B組、C組TNF-α蛋白的表達(dá)呈逐漸增加趨勢；與同期B組相比，28、32周C組大鼠模型TNF-α蛋白的表達(dá)明顯增加。Caspease-3正常對照組的基底細(xì)胞層及棘細(xì)胞層細(xì)胞中有基礎(chǔ)陽性表達(dá)，B組、C組隨造模時(shí)間延長，陽性細(xì)胞表達(dá)率逐漸升高，陽性細(xì)胞的表達(dá)也從基底細(xì)胞增加至棘細(xì)胞層乃至全層；C組與同期B組大鼠模型相比，第28、32周粘膜陽性細(xì)胞表

8、達(dá)率明顯升高。在正常對照組各時(shí)間點(diǎn)，Survivin蛋白均未見陽性表達(dá)，20周時(shí)B組各動物食管粘膜層內(nèi)未見細(xì)胞核Survivin蛋白的陽性表達(dá)，但在棘細(xì)胞層部分細(xì)胞漿中可見陽性表達(dá)，并隨時(shí)間延長表達(dá)逐漸增多，28、32周時(shí)陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目明顯增多，陽性表達(dá)部位灰度值降低；C組大鼠模型各時(shí)間點(diǎn)陽性細(xì)胞灰度值及陽性細(xì)胞數(shù)較A組明顯增高。
　　 結(jié)論：單酸返流、混合返流手術(shù)均能導(dǎo)致大鼠模型食管粘膜上皮凋亡的改變，混合返流手術(shù)較單酸返流