反流對食管粘膜細胞凋亡相關因子作用的實驗研究.pdf

1、目的：本實驗通過建立反流性食管炎（RE）動物模型（單純酸反流、混合反流）及假手術動物模型，觀察各模型組動物存活情況及食管標本肉眼表現，食管標本組織學檢測，并應用免疫組織化學方法檢測TNF-α、Caspease-3、Survivin的表達情況。探討反流對食管下段粘膜細胞凋亡相關因子作用的研究，為臨床防治胃食管反流性疾病提供試驗性理論依據。
　　 方法：選擇健康雄性SD大鼠200只，體重（220-280）克，隨機分為三組：假手術組（

2、A組）40只，單純酸反流組（B組）80只，混合反流組（C組）80只。反流模型制備成功后，分別于術后第20、24、28、32周各組隨機選取8只大鼠分三批頸椎離斷處死，后立即取出大鼠食管組織，用蘇木素伊紅（HE）染色，光鏡下觀察各組大鼠食管粘膜上皮病理變化，采用免疫組織化學方法測定食管粘膜上皮TNF-α、Caspease3、Survivin的表達。實驗結果均以均數±標準差（x±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用t檢驗，應用

3、SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件對實驗數據進行統(tǒng)計學處理，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：術后B組與C組大鼠體重明顯下降，與對照組有明顯差異；術后20天，存活大鼠大部分體重恢復到術前水平，飲食、活動基本正常，體重逐漸增長，但與假手術組比較增長較慢。大鼠死亡時間多發(fā)生在術后一個月內，死亡原因多因術后進食傷口感染、出血、吻合口瘺、腹腔感染、肺部感染等多種原因引起。
　　 大體觀察：A組大鼠食管顏色淡紅，有光澤，粘膜光滑

4、；B組大鼠模型20周時部分大鼠出現食管顏色變淡白，粘膜稍粗糙，隨時間延長出現病變的大鼠數量增多，粘膜增厚及粗糙感亦加重；C組大鼠模型與B組大鼠模型相比：病變表現較同期B組大鼠明顯加重，24周時部分大鼠食管擴張，可見粘膜層出現點狀糜爛，粘膜增厚亦明顯；28周時病變大鼠數量增多，食管粘膜明顯增厚，粘膜皺襞灰白色斑塊加重，導致食管粘膜凹凸不平。32周時灰白色斑塊明顯隆起，呈腦溝回狀，與食管的長軸平行。
　　 光鏡下觀察，HE染色，A組

5、大鼠食管各層結構完整，粘膜厚薄適中，粘膜表面可見較少的角化。B組大鼠模型隨時間延長，粘膜層逐漸增厚，基底細胞層及棘細胞層細胞數目增多，角化層逐漸增厚，32周時可見粘膜層表層出現小的糜爛；C組大鼠模型病變表現較同期B組大鼠明顯加重，除出現上述病變外，24周時部分大鼠食管局部粘膜基底細胞層明顯增生，部分粘膜組織向外呈乳頭樣突起，棘細胞層細胞層次明顯增加，出現顆粒層細胞增加，細胞角化現象逐漸明顯；隨造模時間延長，粘膜明顯增生的范圍不斷增大，從

6、食管與十二指腸及胃吻合口手術部位逐漸發(fā)展至食管中段乃至上段，乳頭樣突起亦明顯增多；與此同時，賁門部胃黏膜上皮發(fā)生腸上皮化生，杯狀細胞明顯增多。28周時部分模型大鼠食管粘膜明顯增生區(qū)向外膨出形成乳頭狀瘤，粘膜表面有大量的不完全角化；部分區(qū)域上皮角向粘膜下層插入，基底細胞增生明顯；發(fā)生不典型增生，并可見散在的單個細胞漿嗜酸性增強，細胞核固縮。此三者皆為食管鱗狀細胞癌的癌前病變表現。C組32周時上述病變進一步加重，但仍未出現典型的食管鱗狀細胞

7、癌病變。
　　 免疫組化：在A組各時間點，TNF-α蛋白在棘細胞層可見微弱的陽性表達。B組、C組TNF-α蛋白的表達呈逐漸增加趨勢；與同期B組相比，28、32周C組大鼠模型TNF-α蛋白的表達明顯增加。Caspease-3正常對照組的基底細胞層及棘細胞層細胞中有基礎陽性表達，B組、C組隨造模時間延長，陽性細胞表達率逐漸升高，陽性細胞的表達也從基底細胞增加至棘細胞層乃至全層；C組與同期B組大鼠模型相比，第28、32周粘膜陽性細胞表

8、達率明顯升高。在正常對照組各時間點，Survivin蛋白均未見陽性表達，20周時B組各動物食管粘膜層內未見細胞核Survivin蛋白的陽性表達，但在棘細胞層部分細胞漿中可見陽性表達，并隨時間延長表達逐漸增多，28、32周時陽性細胞表達數目明顯增多，陽性表達部位灰度值降低；C組大鼠模型各時間點陽性細胞灰度值及陽性細胞數較A組明顯增高。
　　 結論：單酸返流、混合返流手術均能導致大鼠模型食管粘膜上皮凋亡的改變，混合返流手術較單酸返流