苯丙酸諾龍干預(yù)燙傷大鼠雄激素受體介導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：探討苯丙酸諾龍對雄激素受體介導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響，進(jìn)一步了解蛋白同化激素治療燙傷的作用機(jī)制，為蛋白同化激素的臨床應(yīng)用與推廣提供理論依據(jù)。 研究方法：采用隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)，苯丙酸諾龍作為干預(yù)措施，對20％TBSA深Ⅱ°燙傷大鼠模型以及經(jīng)RNA干擾后的培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞進(jìn)行處理，從體內(nèi)和體外兩個(gè)方面，觀測苯丙酸諾龍對大鼠不同組織細(xì)胞類固醇受體輔助活化因子1(SteroidReceptorCoactivator,SRC-1)及下游

2、c-myc、IGF-1基因表達(dá)水平的影響。 1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：Wistar大鼠36只，采用隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對照組與空白組，各12只，實(shí)驗(yàn)組與對照組制備成20％TBSA深Ⅱ°燙傷大鼠模型，實(shí)驗(yàn)組肌注苯丙酸諾龍5mg/kg，對照組用生理鹽水代替，空白組不做任何處理。通過Genebank設(shè)計(jì)合成SRC-1、c-myc、IGF-1基因PCR引物上游F、引物下游R與TaqMan熒光探針。燙傷后21天全部大鼠斷頭處死，剪取肝臟、雙

3、側(cè)睪丸、雙側(cè)卵巢組織約90mg±10mg，TrizolTM法提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，檢測肝臟、睪丸、卵巢組織SRC-1、c-myc、IGF-1基因的表達(dá)水平。 2、體外實(shí)驗(yàn)：通過Genebank設(shè)計(jì)合成大鼠肝細(xì)胞SRC-1的小干涉RNA片段(smallinterferingRNA，siRNA)共4對。采用重組DNA技術(shù)，雙酶切質(zhì)粒pSUPEREGFP1，將siRNA雙鏈連接導(dǎo)入質(zhì)粒pSUPEREGFP1，

4、構(gòu)建siRNA表達(dá)質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)菌落PCR、雙酶切驗(yàn)證、DNA測序篩選出陽性克隆，提取回收純化陽性siRNA表達(dá)質(zhì)粒載體。大鼠肝細(xì)胞株傳代培養(yǎng)，將肝細(xì)胞按4對siRNA、脂質(zhì)體、空白隨機(jī)對照設(shè)計(jì)復(fù)孔種板，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞，進(jìn)行RNA干擾(RNAi)，轉(zhuǎn)染后12、24小時(shí)收集肝細(xì)胞，經(jīng)熒光定量PCR從4對siRNA篩選出最佳RNA干擾效果的siRNA序列。再將培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(+NP+RNAi)、對照組

5、(-NP+RNAi)、實(shí)驗(yàn)空白組(+NP-RNAi)、對照空白組(-NP-RNAi)共4組復(fù)6孔種板，使用篩選出的最佳siRNA質(zhì)粒載體同樣方法轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染干擾后4小時(shí)按10μg/ml苯丙酸諾龍?zhí)幚砀渭?xì)胞，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)收集裂解肝細(xì)胞，以此為模板，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，檢測肝細(xì)胞SRC-1、c-myc、IGF-1基因的表達(dá)水平。 研究結(jié)果：1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苯丙酸諾龍治療20％TBSA深Ⅱ°燙傷大鼠模型前后，大

6、鼠性腺(睪丸、卵巢)實(shí)驗(yàn)組與對照組SRC-1基因表達(dá)水平不同，肝臟、睪丸、卵巢組織實(shí)驗(yàn)組與對照組IGF-1基因的表達(dá)水平不同，兩者P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示苯丙酸諾龍能提高性腺SRC-1和肝臟、睪丸、卵巢IGF-1基因表達(dá)；而肝臟SRC-1基因，肝臟、睪丸、卵巢c-myc基因表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)組與對照組組間差異不明顯，P＞0.05，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示苯丙酸諾龍不能提高肝臟SRC-1和肝臟、睪丸、卵巢c-myc基因表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組SRC-1

7、基因表達(dá)水平與空白組肝臟、睪丸、卵巢三種不同組織SRC-1基因表達(dá)豐度之間存在相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.953，t檢驗(yàn)P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RNA干擾與苯丙酸諾龍干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)空白組，對照組與對照空白兩組比較，肝細(xì)胞SRC-1、IGF-1、c-myc基因表達(dá)水平均明顯降低，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示RNA干擾SRC-1效果優(yōu)良，SRC-1表達(dá)抑制后IGF-1、c-myc表達(dá)也被抑制而下降

8、；實(shí)驗(yàn)組與對照組，實(shí)驗(yàn)空白組與對照空白組，大鼠肝細(xì)胞SRC-1、IGF-1、c-myc基因的表達(dá)水平相似，P＞0.05，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示苯丙酸諾龍?jiān)隗w外不能誘導(dǎo)提高SRC-1、IGF-1、c-myc基因表達(dá)，也不能逆轉(zhuǎn)RNA干擾SRC-1后SRC-1、IGF-1、c-myc基因表達(dá)的下降。 研究結(jié)論：1.苯丙酸諾龍對性腺(睪丸和卵巢)通過細(xì)胞核內(nèi)雄激素受體發(fā)揮作用需要SRC-1基因的正常表達(dá)，SRC-1的正常表達(dá)是IGF-1