HR對核受體VDR靶基因調(diào)控機制的研究.pdf

1、近年來,隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展,Jumonji蛋白家族(JmjC-domain-containingproteins)的許多成員相繼被鑒定為組蛋白賴氨酸去甲基化酶(histone lysinedemethylase,KDM),它們是染色質(zhì)伴隨蛋白(chromatin-associated protein),在染色質(zhì)水平調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與其它過程。Hairless(Hr)是這個家族中的一個成員,生物信息學(xué)分析顯示HR不太可能是一個組蛋白賴氨酸

2、去甲基化酶。但是令人矚目的是,Hr基因的點突變在人和小鼠都會導(dǎo)致毛發(fā)的生長缺陷,表明HR蛋白有著重要的生物學(xué)功能。有報道表明HR參與調(diào)控核受體(nuclear receptor)2 VDR、TR等的靶基因及與WNT通路功能相關(guān),但其中的作用機制并不明確。已知VDR的表達缺陷和WNT通路的功能異常也會導(dǎo)致毛發(fā)的生長缺陷,因此闡明HR與核受體VDR及WNT通路的功能關(guān)系,將有助于為這類疾病的治療提供生化依據(jù)。HR蛋白在細胞內(nèi)作用方式的闡明對

3、解析Jumonji家族其它蛋白的功能亦會有所幫助。
　　 本文主要探討了HR對核受體VDR靶基因的調(diào)控方式,并簡單觀察了HR對WNT通路的作用。
　　 1.通過RT-PCR在mRNA水平檢測了Hairless基因在幾種人的不同組織來源的細胞系的表達,發(fā)現(xiàn)HR在皮膚來源的細胞系如HaCaT和HeLa細胞及神經(jīng)來源的細胞系如SH—SY5Y細胞表達較高,在人胚腎細胞293T亦有表達,在橫紋肌來源的RD細胞幾乎不表達。
　

4、　 2.免疫熒光顯示在293T細胞,外源表達的flag-HR主要分布在細胞核內(nèi),而且不是均勻分布的。構(gòu)建了全長的人HR與EGFP的融合表達質(zhì)粒,在MCF7和293T細胞內(nèi)觀察到,在細胞分裂間期,HR在細胞核內(nèi)表現(xiàn)為三種分布狀態(tài),均勻分布、完全的點狀和介于兩者之間的形態(tài)；在分裂期,HR的分布狀態(tài)與紡錘體形狀頗為相似,表現(xiàn)為在細胞核外的兩個對稱位置有熒光信號的密集分布,并且兩者之間有點狀的熒光信號連接。
　　 3.克隆了人和大鼠的

5、CYP24A1啟動子,發(fā)現(xiàn)在HeLa細胞中過表達HR對人和大鼠的CYP24A1啟動子活性均有抑制作用,并且在用不同濃度的1,25(OH)2D3誘導(dǎo)或不加藥誘導(dǎo)時,抑制作用均存在。
　　 4.克隆了人的RARB啟動子,發(fā)現(xiàn)在HeLa細胞中過表達HR對RARB啟動子的活性有較小的激活作用,這種作用在用10uM的ATRA誘導(dǎo)或不用藥誘導(dǎo)時均存在。
　　 5.通過對大鼠的CYP24A1啟動子的刪切實驗,發(fā)現(xiàn)HR對CYP24A1啟

6、動子活性的抑制與VDRE序列密切相關(guān)。
　　 6.免疫共沉淀實驗提示HR與VDR蛋白之間有相互作用。
　　 7.HeLa細胞中雙熒光報告實驗顯示,20nM trichostatin A(TSA,Ⅰ和Ⅱ類HDAC抑制劑),20mM Nicotinamide(NAM,Ⅲ類HDAC抑制劑)、20uM adenosinedialdehyde(Adox,甲基轉(zhuǎn)移酶的間接抑制劑)和10uM5-Aza-2’-deoxycytidine

7、(5-Aza-dC,DNA甲基化的抑制劑)均不能解除HR對CYP24A1啟動子活性的抑制作用,提示HR的功能不是通過改變組蛋白的乙?；揎?或者組蛋白和DNA的甲基化修飾實現(xiàn)的。
　　 8.染色質(zhì)免疫共沉淀實驗顯示,HR在HeLa細胞的高表達沒有改變CYP24A1啟動子的轉(zhuǎn)錄起始點(-83/142)和上游(-1056/-863)區(qū)域組蛋白H3K4Me3、H3K9Me3、H3K27Me3、H3K4Me2的修飾狀態(tài),進一步證明了HR

8、的功能不是通過改變組蛋白的甲基化修飾實現(xiàn)的。
　　 9.免疫共沉淀實驗提示在HeLa細胞,外源表達的HR與內(nèi)源的核受體共抑制蛋白NcoR1(nuclear receptor corepessor)、msin3A蛋白有相互作用；熒光顯微鏡觀察到EGFP-HR與Cherry-NcoR1(756-2528aa)在293T細胞內(nèi)的亞細胞定位一致;HR的免疫共沉淀蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)中NcoR的肽段覆蓋率為13％,三者結(jié)合可以提示HR與NcoR

9、1蛋白在一個復(fù)合體中。
　　 10.激光共聚焦顯微鏡觀察到EGFP-HR與Cherry-ASH2L和Cherry-HP1α在293T細胞核內(nèi)的定位呈互補分布,提示HR與ASH2L蛋白(被認為常常結(jié)合于活化的染色質(zhì)區(qū))和異染色質(zhì)蛋白HP1α在細胞核內(nèi)分布于不同的區(qū)室。
　　 11.EGFP-HR與Cherry-VDR在293T和MCF7的亞細胞定位一致,結(jié)合以上結(jié)果,提示了HR對VDR的靶基因的抑制作用的可能機制。