樹(shù)莓果實(shí)中多糖的降解、結(jié)構(gòu)及生物活性研究.pdf

1、樹(shù)莓(Rubus idaeus L.)又名木莓、馬林等，多年生落葉小灌木，屬于第三代新興果樹(shù)。其果實(shí)柔軟多汁，色澤鮮艷，味酸甜而富芳香，口感獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，深受人們喜愛(ài)，不僅適于鮮食和加工，還是重要的功能及保健水果，具有抗衰老、抗癌、鎮(zhèn)痛解熱、保護(hù)肝臟等保健功效。目前的研究證實(shí)樹(shù)莓中除了含有多種礦物質(zhì)元素和維生素等物質(zhì)外，還含有大量的多糖、花色苷、黃酮類(lèi)、鞣花酸、SOD等活性組分。在本論文中，從樹(shù)莓（秋福）果實(shí)中提取多糖并降解、分離

2、純化，其后進(jìn)行了結(jié)構(gòu)的初步鑒定及生物活性的研究。首次采用材料廉價(jià)、易得、操作穩(wěn)定簡(jiǎn)便的Fenton試劑法來(lái)降解樹(shù)莓果實(shí)多糖，為進(jìn)一步提高樹(shù)莓多糖的生物利用率和開(kāi)發(fā)高效價(jià)的樹(shù)莓活性物質(zhì)等提供理論依據(jù)。
　　利用水提法提取多糖，其條件為:液料比10∶1 mL/g，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為1h。多糖得率為4.42±0.56％，40％乙醇沉淀，溶解，凍干后得到樹(shù)莓果實(shí)粗多糖，苯酚-硫酸法檢測(cè)其純度為29.23±0.72％。將粗多糖溶解

3、、過(guò)D4020型大孔樹(shù)脂后凍干得到淡黃色的樹(shù)莓果實(shí)多糖(RCPⅠ)，純度為42.39±1.14％，是粗多糖的1.45倍。多糖回收率為72.16±0.39％，表明使用D4020型大孔樹(shù)脂純化多糖條件合適，損失率較低。用兩種不同的Fenton試劑法降解RCPⅠ得到兩種淡綠色的降解后樹(shù)莓果實(shí)多糖(DRCPⅠ、DRCPⅡ)，苯酚-硫酸法檢測(cè)其純度分別為43.53±1.03％、46.74±0.87％，分別為RCPⅠ的1.03、1.10倍。經(jīng)過(guò)蛋白

4、質(zhì)含量、多酚含量、花色苷含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)RCPⅠ、DRCPⅠ、DRCPⅡ中幾乎不含有蛋白質(zhì)、多酚、花色苷這三種雜質(zhì)。對(duì)RCPⅠ、DRCPⅠ、DRCPⅡ進(jìn)行糖醛酸含量的測(cè)定，結(jié)果顯示其中糖醛酸含量為29.28±0.42％、35.07±0.81％和33.60±0.54％，表明降解后多糖中糖醛酸含量略高于降解前多糖。
　　在物理性質(zhì)的測(cè)定中，RCPⅠ、DRCPⅠ、DRCPⅡ都能溶于水而難溶于有機(jī)溶劑（乙醇、乙酸乙酯、乙醚等），但在水溶性方

5、面降解前后多糖有差異。降解使多糖的溶解性增加。經(jīng)高效液相色譜測(cè)定多糖的分子量結(jié)果顯示，多糖RCPⅠ并不是均一組分，其主要組分的重均分子量為745983Da。兩種降解后的多糖DRCPⅠ與DRCPⅡ則為均一組分，重均分子量分別為16421Da、11832 Da?？寡趸钚缘臏y(cè)定結(jié)果顯示，無(wú)論是降解前多糖RCPⅠ還是降解后多糖DRCPⅠ、DRCPⅡ都表現(xiàn)出了一定的清除自由基活性與總還原能力，且效果明顯，而其金屬離子螯合能力均較弱。降解后的樹(shù)莓

6、多糖全部都明顯表現(xiàn)出優(yōu)于降解前的抗氧化能力，且DRCPⅡ的活性要高于DRCPⅠ。結(jié)合純度、溶解性、分子量等方面考慮決定選擇對(duì)DRCPⅡ進(jìn)行進(jìn)一步的純化、結(jié)構(gòu)鑒定以及活性研究。
　　采用瓊脂糖凝膠Sepharose-6B分別對(duì)多糖RCPⅠ、DRCPⅡ進(jìn)行分離純化，洗脫劑為去離子水，上樣量1.0 mL，洗脫流速0.80 mL/min，上樣濃度分別為15 mg/mL、20 mg/mL，得到兩種純化后多糖RCPI-2、DRCPⅡ-2，濃縮

7、，凍干。苯酚-硫酸法檢測(cè)其純度分別為59.82±0.54％、61.83±0.72％。用Sepharose-6B凝膠柱層析法、凍融法和紫外光譜法分別對(duì)RCPⅠ-2、DRCPⅡ-2進(jìn)行純度鑒定表明RCPⅠ-2、DRCPⅡ-2均為均一組分。
　　多糖RCPⅠ-2和DRCPⅡ-2外觀分別為白色、淡綠色絮狀物。兩種多糖都易溶于水而難溶于有機(jī)溶劑。多糖RCPⅠ-2和DRCPⅡ-2水溶液pH為4.96±0.38、4.83±0.62，均為酸性多糖

8、。采用高效液相色譜法對(duì)其分子量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，其分子量分別為410912 Da、8019Da，與純化前多糖相比分子量均有所降低。
　　氣相色譜圖顯示RCPI-2中各單糖組成的物質(zhì)量比為:半乳糖醛酸∶鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=1∶0.148∶0.647∶0.258∶0.110∶0.101∶0.445。DRCPⅡ-2中各單糖組成的物質(zhì)量比為:半乳糖醛酸∶鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=1∶0

9、.211∶0.387∶0.188∶0.358∶0.419∶0.427。紅外光譜測(cè)定分析顯示，RCPⅠ-2和DRCPⅡ-2主要由呋喃環(huán)構(gòu)成，主要存在α型的糖殘基，且均含有糖醛酸，降解并沒(méi)有破壞多糖原有的骨架結(jié)構(gòu)。在高級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定中，掃描電鏡圖顯示從圖中可以看出降解后多糖的片狀結(jié)構(gòu)較小、表面更為光滑。而剛果紅試驗(yàn)顯示降解前后多糖均不具有三螺旋結(jié)構(gòu)，與掃描電鏡中觀察到的片狀形態(tài)符合。
　　樹(shù)莓果實(shí)多糖DRCPⅡ-2的降血糖活性研究包括抗

10、糖基化能力試驗(yàn)（初期Amadori產(chǎn)物抑制試驗(yàn)、中期二羰基化合物抑制試驗(yàn)和末期AGEs抑制實(shí)驗(yàn)）以及抑制α-淀粉酶活性試驗(yàn)。多糖DRCPⅡ-2抗糖基化試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)糖基化反應(yīng)三個(gè)階段產(chǎn)物的形成均表現(xiàn)出一定的抑制作用，但效果低于對(duì)照氨基胍。其中，多糖DRCPⅡ-2對(duì)反應(yīng)初期產(chǎn)物的抑制率要高于反應(yīng)中期和末期，表明了反應(yīng)初期是DRCPⅡ-2發(fā)揮其抑制作用的主要時(shí)期。這一結(jié)果與對(duì)照組氨基胍一致。在最大抑制率時(shí)，不同濃度DRCPⅡ-2之間的抑制