牛型分枝桿菌四種特異性蛋白嵌合體在診斷中的應(yīng)用.pdf

1、本文論述了牛型分枝桿菌四種特異性蛋白嵌合體在診斷中的應(yīng)用，全文主要內(nèi)容如下： 1．牛型分枝桿菌cfp10-esat-6融合基因的克隆及表達(dá)。 應(yīng)用PCR方法從牛分枝桿菌臨床分離株基因組中擴(kuò)增獲得cfp-10和esat-6四個目的基因片段，通過引入一段Linker序列構(gòu)建cfp10-esat-6融合基因；并且克隆入表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)。經(jīng)測序確認(rèn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，成功表達(dá)了具有良好抗原性的CF

2、P10-ESAT-6融合蛋白。 2．牛型分枝桿菌MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白的表達(dá)。 應(yīng)用PCR方法從牛型分枝桿菌臨床分離株基因組中擴(kuò)增獲得mpb70、mpb83、eft10和esat-6四個目的基因片段，測序鑒定序列的正確性。采用重疊延伸剪接技術(shù)(splicing by overlap extension， SOE)獲得融合基因cfp10-esat-6和mpb83-cfp10-esat-6，

3、將mpb70和mpb83-cfp10-esat-6串連于載體pUC19-Link上，再將mpb70-mpb83-cfp10-esat-6連于表達(dá)載體pET28a(+)中得到重組質(zhì)粒0ET-28a-MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6。轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得可溶性表達(dá)的融合蛋白。用Ni<'++>親合層析柱純化該融合蛋白。ELISA及Western blot鑒定融合蛋白的免疫活性，熱處理法分

4、析蛋白的熱穩(wěn)定性。經(jīng)EIASA驗證該融合蛋白能分別與抗原蛋白MPB70、MPB83和CFP10-ESAT-6的多抗反應(yīng)，說明該融合蛋白具有單個抗原的免疫學(xué)活性。Western blot分析顯示，該融合蛋白能與抗牛型分枝桿菌陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而與其它非相關(guān)抗原的陽性參考血清如牛副結(jié)核病、牛布氏桿菌病、牛巴貝斯病和牛傳染性鼻氣管炎病陽性血清等不反應(yīng)。熱穩(wěn)定性試驗證明該融合蛋白為一種熱穩(wěn)定性好的蛋白。通過基因工程融合表達(dá)了牛型分枝桿菌的

5、四種特異性抗原蛋白，該蛋白具有單個蛋白的免疫原性和穩(wěn)定性，作為一種新型的診斷抗原具有良好的應(yīng)用前景。 3．牛結(jié)核病EIASA抗體檢測方法的臨床應(yīng)用。 大腸桿菌原核表達(dá)MPB70-MPB83．CFP10-ESAT-6融合抗原，進(jìn)行純化與鑒定后，以此為診斷抗原建立了牛結(jié)核病間接ELISA．抗體檢測(iELISA)的診斷方法。數(shù)據(jù)結(jié)果用血清樣本與陽性對照和陰性對照的OD<,630>相對值(S/P)表示，用90份健康牛血清檢測結(jié)

6、果確定陰陽性臨界值S/P為0.17。iEIISA與常見非相關(guān)牛病的參考陽性血清無交叉反應(yīng)。 以結(jié)核菌素皮膚試驗(TST)為參考方法，檢測了華中地區(qū)四個奶牛場的560頭黑白花奶牛。在所檢測的560份血清中，iELISA陽性105份，陰性455份；TST陽性76份，陰性484份；兩種方法共同檢出陽性樣本55份，共同檢出陰性樣本434份，總符合率為87.32％。以TST為金標(biāo)準(zhǔn)，則iELISA的敏感性為72.37％(55/76)，特異

7、性為89.67％(434/484)。另外，又用iELISA、膠體金試紙條(CGST)和細(xì)菌培養(yǎng)平行檢測了其中150頭黑白花奶牛。iELISA與CGST的符合率為93.33％(140/150)，采集其中22頭奶牛鼻拭子分菌培養(yǎng)，iELISA與細(xì)菌培養(yǎng)的符合率為77.27％(17/22)。對這22頭皮試陽性牛進(jìn)行跟蹤檢測，第一次檢測抗體陽性率為36％(8/22)，7個月后再次采樣，22頭陽性牛中有6頭已被淘汰，其余16頭抗體檢測均為陽性，檢

8、出率為100％(16/16)，表明牛型分枝菌感染誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)滯后于細(xì)胞免疫反應(yīng)。檢測來自湖北武漢地區(qū)和宜昌地區(qū)共計1014份血清樣品，其中陽性167份，陰性血清847份，總體陽性率為16.47％。不同牛場間陽性率差異很大，從0％-65％不等。總體上小型養(yǎng)殖場(<100頭)陽性率較高，部分奶牛場結(jié)核污染嚴(yán)重；大型養(yǎng)殖場陽性率較低。 進(jìn)一步檢測了來自于中國30個省市的1344份奶牛血清，結(jié)果表明牛型分枝桿菌血清抗體陽性率平均為