表達(dá)外源性中分子量神經(jīng)細(xì)絲及核轉(zhuǎn)位對細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、早老性癡呆（Alzheimer Disease，AD）和其它多種神經(jīng)退行性疾病均有神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFT）存在于大腦，NFT由過度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau、神經(jīng)細(xì)絲（neurofilament，NF）等組成。很多研究已證實過表達(dá)tau有抗凋亡的作用，且胞核內(nèi)的去磷酸化tau對DNA有保護(hù)作用，但是關(guān)于神經(jīng)細(xì)絲對細(xì)胞生存的影響還不清楚。本研究的目的是探討外源性NFM及其細(xì)胞內(nèi)的定位對細(xì)胞凋亡的影響。將中分子量的神經(jīng)細(xì)絲（NFM）和人全長

2、的tau（tau441）的質(zhì)粒（EGFP-C1-NFM、EGFP-C1-tau和 HA-C1-NFM、HA-tau質(zhì)粒）轉(zhuǎn)染鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞株（N2a）36 h后，用1μmol/L廣譜凋亡誘導(dǎo)劑staurosporine（STP）處理細(xì)胞不同時間，流式結(jié)果顯示，凋亡誘導(dǎo)后3 h、6 h、12 h和24 h，與空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，表達(dá)外源性tau組的凋亡率均明顯降低（3 h，p<0.05；6 h-24 h，p<0.01），而各時間點轉(zhuǎn)染NF

3、M組與空質(zhì)粒組凋亡率均無顯著性差異，說明表達(dá)外源性NFM沒有抗凋亡作用。通過免疫熒光結(jié)果分析兩者的定位：內(nèi)源性tau低表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，而外源性tau在胞漿胞核中均有表達(dá)，內(nèi)源性NFM表達(dá)極低，幾乎不可見，外源性的NFM主要定位在N2a細(xì)胞漿中。進(jìn)一步分離胞漿蛋白和胞核蛋白，通過免疫印跡技術(shù)檢測以上兩種外源性蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，結(jié)果為內(nèi)源性tau表達(dá)極低，轉(zhuǎn)染tau質(zhì)粒后外源性tau在胞核和胞漿內(nèi)均含有。與tau在細(xì)胞內(nèi)的定位不同，NFM基

4、本不表達(dá)于胞核。為了探討是否NFM表達(dá)在胞漿是其不抑制細(xì)胞凋亡的原因或者原因之一，構(gòu)建了帶核定位序列（nuclear location signal，NLS）的NFM質(zhì)粒：EGFP-C1-NLS-NFM和HA-C1-NLS-NFM質(zhì)粒及其相應(yīng)空載體，免疫熒光結(jié)果顯示，帶核定位序列的EGFP-C1-NLS-NFM或者HA-C1-NLS-NFM質(zhì)粒表達(dá)的NFM可以部分入核。STP處理細(xì)胞后，免疫熒光結(jié)果顯示，帶核定位序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)染陽性