聚乳酸納米粒介導decoy策略調控腦血管內皮細胞組織因子活性的研究.pdf

1、腦血栓形成發(fā)生機制復雜，一直缺乏切實有效的防治方法。本研究運用近年來興起的納米技術，將干預基因片段定向導入腦血管內皮細胞，運用抑制組織因子的基因療法探索防治腦血栓形成的新途徑；研究中運用細胞生物學及分子生物學技術檢測腦血栓疾病中血管內皮細胞表面組織因子表達及活性變化，明確其在腦血栓形成中的作用；進而應用Decoy策略從轉錄水平研究組織因子活性的調控因素及機理；以聚乳酸為材料，通過表面修飾等方法，研制具有腦血管內皮細胞靶向性的納米粒，以納

2、米粒為載體，將Decoy寡核苷酸片段定向導入腦血管內皮細胞，通過干預組織因子活性實現對腦血栓形成的早期預防和治療，為腦血管疾病的基因治療從實驗室邁向臨床提供有力的基礎。 第一部分腦微血管內皮細胞組織因子的表達及調控機制研究 目的：研究大鼠腦微血管內皮細胞(BMECs)中核因子κB(NF-κB)在組織因子(TF)表達調控中的作用； 方法：分離、培養(yǎng)大鼠BMECs，分別經LPS、TNF-α刺激0、1h、2h、4h、8

3、h、16h不同時間后，運用流式細胞術檢測BMECs胞膜表面TF表達量的變化，RT-PCR檢測TFmRNA表達水平的變化，WesternBlot檢測刺激因子對細胞核內活化的NF-κB組份P65含量的影響；并觀察NF-κB的特異性抑制劑PDTC對BMECs中TFmRNA表達水平的影響作用； 結果：TF在BMECs細胞中的表達同刺激因子作用呈現時間依賴關系，10μg/mlLPS或100ng/mlTNF-α刺激1～2h時TFmRNA水平

4、達到峰值，核內P65含量相應顯著增高；經100μmol/LPDTC預處理的BMECs在刺激因子誘導下，TF表達水平不升高； 結論：BMECs在受到炎癥因子、細菌內毒素刺激時TF表達增高，NF-κB活化在LPS或TNF-α誘導的BMECsTF表達的轉錄調控中有重要作用。 第二部分腦血管內皮細胞靶向性納米粒載體的研制 目的：制備聚乳酸(polylacticacid，PLA)納米粒，研究該納米載體在小鼠各臟器組織中的

5、分布特征，探討其對鼠腦組織的靶向性； 方法：納米沉積法制備空白及經聚山梨醇-80(T-80)表面修飾的PLA納粒，原子力顯微鏡觀測微觀形貌、粒徑，zeta電位/粒度分析儀分別測定粒度分布范圍和zeta電位值；MTT比色法評價納米粒的細胞毒性；熒光分光光度計檢測并比較不同表面特性的PLA納米粒在小鼠各臟器組織的分布，巨噬細胞吞噬實驗評價T-80表面修飾對于PLA納米粒逃避單核—巨噬系統(tǒng)吞噬的作用；透射電鏡觀察腦組織中納米粒的分布區(qū)

6、域，分析電鏡對腦血管內皮細胞中葉綠素銅標記的納米粒進行鑒定； 結果：所制PLA納粒為規(guī)整、均勻的球形顆粒，其等效粒徑為162.1nm，多分散系數為0.108；T-80修飾的聚乳酸納米粒能特異性地分布于小鼠腦組織，透射電鏡及分析電鏡證實腦微血管內皮細胞中有納米粒的聚集； 結論：T-80表面修飾的PLA納米粒能較特異性地被鼠腦血管內皮細胞攝取，該載體可能成為選擇性作用于腦血管內皮細胞的優(yōu)良給藥載體。 第三部分載NF

7、-κBdecoy聚乳酸納米粒對腦微血管內皮細胞TF表達調控的體外研究 目的：探討由PLA納米粒包裹的NF-κBdecoy寡核苷酸片段對體外培養(yǎng)的大鼠腦BMECs組織因子表達活性的調控功能； 方法：制備包裹熒光標記NF-κBdecoy的納米?；鞈乙?，檢測其物理表征、包封率和體外釋放情況。共聚焦顯微鏡和流式細胞術觀察和檢測培養(yǎng)的BMECs攝取載decoy-納米粒的效率和細胞內分布，運用RT-PCR及Westernblot技術

8、比較攝取納米粒的細胞在LPS刺激下TFmRNA和胞核內P65表達豐度的變化； 結果：制備的decoy-納米粒平均粒徑為302nm，多分散系數為0.036，體外釋放實驗顯示經28天其總釋放率達92.3％，流式細胞儀檢測到BMECs對decoy-納米粒平均攝取率達到(90.4±5.26)％，被攝取的decoy-納米粒位于細胞胞漿內，RT-PCR結果提示經納米粒包載的NF-κBdecoy具有生物活性，可以顯著抑制LPS作用下腦微血管內

9、皮細胞的TF表達水平，蛋白印跡結果顯示核提取物中P65的豐度顯著降低； 結論：聚乳酸納米粒能將NF-κBdecoy寡核苷酸片段遞送至細胞內，且能保持生物活性，該方法為腦血栓病基因治療的可能性提供了依據。 第四部分載NF-κBdecoy聚乳酸納米粒在腦微血栓形成動物模型中作用的研究目的：探討由PLA納米粒包裹的NF-κBdecoy寡核苷酸片段對大鼠腦皮質微血栓形成模型局部TF表達的調控作用； 方法：光化學誘導法建

10、立大鼠腦皮質微血栓形成模型，靜脈注射decoy-納米粒后，應用原位雜交的方法研究模型動物微血管內皮細胞中TF表達，ELISA技術研究模型動物血漿TF含量的變化； 結果：熒光顯微鏡觀察到decoy-納米粒能進入模型動物的腦微血管內皮細胞，NF-κBdecoyODNs經PLA納米粒導入模型動物后，照射部位內皮細胞TFmRNA表達顯著下降，而注射對照M-decoy納米粒和空白對照組的模型動物TFmRNA仍呈高表達，血漿TF含量變化與T