分枝桿菌脂聚糖的分離、純化及其結(jié)構(gòu)和功能的初步探索.pdf

1、　　目的：建立分離、純化分枝桿菌脂聚糖的方法,初步比較分析不同菌株來源的脂阿拉伯甘露聚糖(Lipoarabinomannan,LAM)和脂甘露聚糖(Lipomannan, LM)結(jié)構(gòu)差異,探討不同菌株來源LAM和LM的抗原性及研究脂聚糖刺激對(duì)巨噬細(xì)胞環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)蛋白表達(dá)的影響。這些研究為深入揭示其對(duì)宿主的毒力和免疫機(jī)制,尋找安全高效的天然靶點(diǎn)藥物及診斷試劑的制備奠定基礎(chǔ)。
　　方

2、法：應(yīng)用Triton X-114液相法提取脂聚糖,電洗脫法分離純化,基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MS)進(jìn)行分子量鑒定；基于特異性識(shí)別非還原性末端α-D-甘露糖基的刀豆球蛋白(Concanavalin A,Con A)分析新諾分枝桿菌 JDM601、結(jié)核分枝桿菌北京基因型臨床分離株 WXT6、結(jié)核分枝桿菌 H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株、牛分枝桿菌 BCG、恥垢分枝桿菌 mc2155和結(jié)核分枝桿菌H37Ra株脂聚糖

3、的結(jié)構(gòu)差異；并將純化的脂聚糖作為抗原,通過ELISA方法檢測結(jié)核患者和健康對(duì)照組血清中的相應(yīng)抗體；進(jìn)一步采用Western blot 檢測脂聚糖刺激的RAW 264.7巨噬細(xì)胞COX-2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：通過電洗脫法成功純化出六種菌株脂聚糖；MALDI-TOF/TOF-MS 鑒定發(fā)現(xiàn),依據(jù) LAM的分子量由小到大,依次為新諾分枝桿菌 JDM601、恥垢分枝桿菌 mc2155、結(jié)核分枝桿菌北京基因型臨床分離株 WXT6、牛

4、分枝桿菌 BCG、結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株、結(jié)核分枝桿菌H37Ra來源的脂聚糖。此外,新諾分枝桿菌JDM601和恥垢分枝桿菌mc2155來源的LM分子量較小,而其余四種結(jié)核分枝桿菌來源的LM分子量較大,但大小差異較小。研究顯示,Con A能與結(jié)核分枝桿菌北京基因型臨床分離株WXT6、牛分枝桿菌BCG、結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株和結(jié)核分枝桿菌 H37Ra 來源的 LAM 相互作用,而不能與新諾分枝桿菌JDM601和恥垢分枝桿菌mc2

5、155來源的LAM相互作用；并且發(fā)現(xiàn)Con A與新諾分枝桿菌JDM601來源的 LM有很強(qiáng)的反應(yīng),然而與其余五種來源的 LM反應(yīng)很弱。
　　應(yīng)用 ELISA方法分析脂聚糖抗原性的結(jié)果表明,M. tuberculosis H37Rv、M. bovis BCG、M. smegmatis mc2155和M. tuberculosis H37Ra四種不同分枝桿菌菌株來源LM的P/N值均較小,表明不適合 ELISA實(shí)驗(yàn)；而用四種不同分枝

6、桿菌菌株來源的LAM作為抗原,檢測了28例結(jié)核患者,16例健康人血清,顯示結(jié)核組和健康組均值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并且反應(yīng)強(qiáng)度具有差異。
　　Western blot 分析M. sinov JDM601、M. tuberculosis H37Rv和M. smegmatis mc2155來源 LAM和 LM刺激的 RAW 264.7巨噬細(xì)胞 COX-2表達(dá)發(fā)現(xiàn),三種菌株來源的脂聚糖均能刺激RAW 264.7巨噬細(xì)胞COX-2蛋白的表