Cav-1-AKF-PD抗肺纖維化治療新靶點.pdf

1、目的：
　　觀察氟非尼酮（Fluorofenidone，AKF-PD）抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-31）誘導(dǎo)原代正常肺成纖維細(xì)胞（Normal Human Lung fibroblasts，NHLFs）活化和細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)合成的作用，探討調(diào)控小窩蛋白-1(caveolin-1，cav-1)表達(dá)在AKF-PD抗肺纖維化機制

2、中的作用。
　　方法：
　　1.NHLFs的原代培養(yǎng)、鑒定及純化傳代:于肺葉切除術(shù)中取病變遠(yuǎn)端的正常肺組織，采用組織塊培養(yǎng)法進行NHLFs的原代培養(yǎng)，將培養(yǎng)的細(xì)胞純化傳代至第3代細(xì)胞凍存?zhèn)溆谩?br>　　2.取NHLFs第3-7代使用，首先將實驗分為5組(n=5)，分別為空白對照組（N組）、TGF-β1(10ng/ml)處理組（M組）、TGF-β1(10ng/ml)+高、中、低濃度AKF-PD(200μg/ml、400μg/

3、ml、800μg/ml)治療組（A200、A400、A800組），各組于細(xì)胞接種后相應(yīng)處理12h、24h、48h、64h、72h，收集細(xì)胞提取總蛋白，采用Western Blot檢測cav-1、α-平滑肌動蛋白(Alpha smooth muscleactin，α-SMA)、纖維連接蛋白（fibronectin， FN）的蛋白表達(dá);
　　3.取NHLFs第3-7代使用，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計、制備得到3個不同序列的正常人c

4、av1-siRNA，再將實驗分為7組，分別為空白對照組（N組）、TGF-β1(10ng/ml)處理組（M組）、Co-siRNA轉(zhuǎn)染組、Co-siRNA+TGF-β1(10ng/ml)處理組、cav1-siRNA轉(zhuǎn)染組、cav1-siRNA+TGF-β1(10ng/ml)處理組、cav1-siRNA+TGF-β1(10ng/ml)+AKF-PD(400μg/ml)處理組，各組于細(xì)胞接種后相應(yīng)處理48h，收集細(xì)胞提取總蛋白，采用Wester

5、nBlot檢測cav-1、α-SMA、FN的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.隨著TGF-β1(10ng/ml)作用時間的延長，cav-1的表達(dá)逐漸減少(p＜0.05)，并且具有時間依賴性;細(xì)胞α-SMA、FN的表達(dá)先增加后減少(p＜0.05)。
　　2.TGF-β1能顯著下調(diào)細(xì)胞cav-1的表達(dá)(p＜0.05)，能明顯上調(diào)細(xì)胞α-SMA、FN的表達(dá)(p＜0.05)，細(xì)胞活化與ECM合成的最佳時間為48h時。
　　

6、3.隨著AKF-PD(200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml)濃度的增加，與TGF-β1(10ng/ml)共同接種細(xì)胞48h后，細(xì)胞cav-1的表達(dá)逐漸增加(p＜0.05)，，細(xì)胞α-SMA、FN的表達(dá)逐漸減少(p＜0.05)，并且具有劑量依賴性。AKF-PD作用的最佳濃度為400μg/ml，能顯著抑制TGF-β1的作用，能部分恢復(fù)細(xì)胞cav-1的表達(dá)(p＜0.05)，能明顯下調(diào)細(xì)胞α-SMA、FN的表達(dá)(p＜0.05)。

7、
　　4.Co-siRNA轉(zhuǎn)染對cav-1表達(dá)無影響:Co-siRNA轉(zhuǎn)染后，與N組比較，細(xì)胞cav-1、α-SMA及FN的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5.cav1-siRNA成功干擾cav1的表達(dá):cav1-siRNA轉(zhuǎn)染后，與N組比較，細(xì)胞cav-1的表達(dá)幾乎消失(p＜0.05)，細(xì)胞α-SMA、FN的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。而最佳轉(zhuǎn)染序列為cav1-siRNA-2，細(xì)胞cav-1沉默最明顯

8、(p＜0.05)，細(xì)胞α-SMA、FN的表達(dá)幾乎與N組相同。
　　6.TGF-β1處理后的Co-siRNA轉(zhuǎn)染組:與單純Co-siRNA轉(zhuǎn)染組比較，細(xì)胞cav-1的表達(dá)明顯減少(p＜0.05)，細(xì)胞α-SMA、FN的表達(dá)明顯增多(p＜0.05);與M組比較，細(xì)胞cav-1、α-SMA、FN的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　7.TGF-β1處理后的cav1-siRNA轉(zhuǎn)染組:與單純cav1-siRNA轉(zhuǎn)染組比較，細(xì)

9、胞cav-1的表達(dá)有所減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，細(xì)胞α-SMA、FN的表達(dá)明顯增多(p＜0.05);與M組比較，細(xì)胞cav-1的表達(dá)明顯減少(p＜0.05)，細(xì)胞α-SMA、FN的表達(dá)有所減少(p＜0.05)。
　　8.TGF-β1+AKF-PD共同處理后的cav1-siRNA轉(zhuǎn)染組:與TGF-β1處理后的cav1-siRNA轉(zhuǎn)染組比較，細(xì)胞cav-1、α-SMA、FN的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。