Mel受體基因的克隆及原位雜交法檢測其在雞免疫器官中的表達規(guī)律.pdf

1、本研究通過控制不同光照時間(長光照組(18h)、短光照組(6h)、對照組(12h)和注射外源性褪黑素(低劑量組(10mg/kg)、高劑量組(20rag/kg)、對照組(Omg/kg))來改變雞體內(nèi)褪黑素的分泌量，利用經(jīng)典血細胞計數(shù)法和流式細胞術(shù)對外周血白細胞數(shù)、紅細胞數(shù)，T、B淋巴細胞及其亞群進行計數(shù)，RT-PCR技術(shù)對褪黑素3型受體(Mella、Mellb、Mellc)基因進行分子克隆與序列分析，同時原位雜交法檢測在雞的胸腺、脾臟、腔

2、上囊中的mRNA表達規(guī)律。結(jié)果表明： 采用經(jīng)典血細胞計數(shù)法，發(fā)現(xiàn)隨著光照時間的縮短，褪黑素分泌量的升高，雞外周血中的白細胞數(shù)(P<0.01)、紅細胞數(shù)(P<0.01)、血紅蛋白含量均極顯著升高(P<0.01)；隨著光照時間的延長，褪黑素分泌量的降低，雞外周血中的白細胞數(shù)(P<0.01)、紅細胞數(shù)(P<0.01)、血紅蛋白含量(P<0.01)均極顯著降低。 采用流式細胞術(shù)檢測T、B淋巴細胞及其亞群的消長規(guī)律，結(jié)果表明長光照

3、組(18h)隨Mel分泌量的降低，CD3<'+>CD4<'+>、CD3<'+>CD8<'+> T細胞和Bu-1a<'+>B細胞含量都明顯降低，且與對照組相比，差異極顯著(P<0.01)：短光照組(6h)隨Mel分泌量的升高，CD3<'+>CD4<'+>、CD3<'+>CD8<'+> T細胞和Bu-1a<'+>B細胞含量都明顯升高，且與對照組相比，差異極顯著(P<0.01)。注入外源性褪黑素后，CD4<'+>、CD8<'+> T細胞和Bu

4、-la<'+>B細胞含量都有明顯升高，且給藥低劑量組與對照組相比顯著升高（P<0.05)，給藥高劑量組與對照組相比極顯著升高(P<0.01)(除Bu-la<'+>B細胞外)。 根據(jù)GenBank登載的雞褪黑素3型受體chickenU 31820(Mella)、chickenU 30609(Mel lb)、chickenu 3182l(Mellc)cDNA序列設(shè)計3對引物，采用RT-PCR技術(shù)從雞腦組織中擴增出褪黑素3型受體的部分

5、cDNA片段，長度分別為603bp、463bp和504bp，序列分析表明本試驗所得雞3型褪黑素受體cMella、cMellb和cMellc的核苷酸序列與GenBank中chickenu 31820(Mella)、chickenu 30609(Mellb)、chic：kenu31821(Mellc)相對應(yīng)部位的同源性非常高，分別為99.0％、97.2％和99.4％。 采用地高辛分別標記雞褪黑素3型受體基因制成cDNA探針，用原位雜