人源Polδ最小亞基p12 Calpain酶解位點分析及泛素化修飾E2-E3確定.pdf

1、由四個亞基構成的真核生物DNA聚合酶δ(DNA polymeraseδ，Polδ)是染色體DNA復制過程中最主要的復制酶之一，同時，它還通過缺口填補和重新合成DNA的方式，在參與多種形式DNA修復過程中起著關鍵作用。
　　通過對人源Polδ的深入研究，進一步發(fā)現(xiàn)Polδ是一個DNA損傷響應的靶目標，通過射線誘導或者遺傳毒物處理體外培養(yǎng)的人源細胞，在引起DNA損傷的情況下，Polδ的最小亞基p12能夠在ATR/Chk1通路調(diào)控下以泛

2、素化依賴的形式降解，從而導致細胞內(nèi)Polδ由原來的四聚體形式Polδ4轉換為三聚體Polδ3以應對DNA損傷。但到目前為止，對p12在ATR/Chk1通路調(diào)控下被降解（下調(diào)）的泛素修飾機制不清楚，因為要從眾多的E3中確定出特異性識別和介導p12進行泛素化修飾的連接酶E3，以及尋找E2/E3系統(tǒng)調(diào)控p12泛素化修飾途徑是一項工作量較為龐大的實驗。本研究組最新研究還發(fā)現(xiàn)，通過細胞凋亡誘導試劑或相關誘導藥物等處理宮頸癌HeLa細胞，在鈣離子誘

3、導激活Calpain途徑的HeLa細胞凋亡過程中，p12亞基能夠被Calpain所降解，揭示了Polδ在參與細胞凋亡過程中的新功能，但對Calpain蛋白是如何識別并酶解p12的機制并不清楚。
　　針對以上問題，本論文研究首先擬構建五個帶GST標簽的p12融合蛋白片段D1-D5，建立Calpain酶解p12的體外反應體系，通過分析那個片段能夠被Calpain所酶解，對p12被μ-Calpain降解的酶解位點進行定位;同時，通過建立

4、p12泛素化修飾體外反應系統(tǒng)，結合質(zhì)譜分析聯(lián)用，將體外培養(yǎng)的HeLa細胞抽提物經(jīng)過四個不同性質(zhì)的層析柱進行分離純化，以查找能夠特異性識別p12的E3鏈激酶，并確定介導p12多泛素化反應E2/E3調(diào)控系統(tǒng)。
　　實驗結果表明，只有p12的D2和D3片段能夠被μ-Calpain所降解，通過比較GST和GST-p12對照組的酶解反應情況，經(jīng)分析，初步確定酶解位點可能位于D2和D3之間一段重疊的氨基酸序列，即:28LAPELGEEPQPR

5、DEEE43;大規(guī)模查找特異性識別靶蛋白p12的E3和E2/E3調(diào)控系統(tǒng)的實驗表明，唯一能夠特異性識別p12的E3鏈激酶為RNF8;而介導p12多泛素化反應的E2/E3調(diào)控系統(tǒng)被確定為UbcH13/Uev1a/RNF8。
　　本論文研究對闡明Calpain降解p12的酶解機制，以p12/Polδ在依賴Calpain激活途徑細胞調(diào)亡中過程作為一個潛在的重要靶標，針對某種特定的腫瘤細胞進行化療藥效的快速評估，具重要的理論參考和潛在的實