人源DNA聚合酶δ最小亞基p12在細胞凋亡過程中降解途徑分析.pdf

1、人源DNA聚合酶δ(Polδ)是由四亞基組成的異源四聚體，其中p125為催化大亞基，其它三個較小亞基分別為p50、p68和p12，而p12通常又被稱為第四亞基或最小亞基。研究表明，DNA聚合酶δ不僅在DNA復制過程中扮演重要的角色，同時還參與多種形式的DNA損傷修復，在維持細胞周期的正常調節(jié)以保證基因組結構的完整性和遺傳的穩(wěn)定性等方面具有特殊的重要意義。
　　動物細胞對DNA的損傷響應(DNA damage response，DD

2、R)主要是通過宿主的保護機制來完成，所有的保護機制均涉及到相關蛋白復合體的裝配和各種DNA損傷響應的信號網(wǎng)絡激活，包括一系列的細胞周期檢查點激活和DNA修復機制的響應以及細胞是否進入到程控凋亡來實現(xiàn)，從而保證其遺傳信息的完整性。近期研究表明，Polδ也受到DDR的調控。體外培養(yǎng)的人源細胞通過遺傳毒物處理或射線誘導而引起DNA損傷的情況下，細胞內(nèi)Polδ由原來的四聚體全酶形式Polδ4轉換為三聚體Polδ3以應對DNA損傷。轉換后的三聚體

3、Polδ3比Polδ4具有更強的糾正引物和模板上錯誤核苷酸的能力。因此，Polδ3被認為是DNA損傷后Polδ的主要活性形式，它可以參與到DNA修復過程中完成缺口的填補以及S-期細胞的跨損傷合成過程中。在跨損傷合成聚合酶轉換的模型中，Polδ3作為轉換過程中Polδ的主要形式，通過Polη/ub-PCNA/Polδ3復合體共同完成兩種聚合酶之間的迅速轉換。進一步的研究表明，p12亞基是通過ATR通路調控下以泛素化依賴的形式降解，在此過程

4、中UbcH5c和RNF8作為一組E2/E3發(fā)揮重要作用，由RNF8介導的p12亞基降解使得Polδ4變成Polδ3，這一過程是細胞應對DNA損傷響應的重要環(huán)節(jié)。但是，如果DNA耐損傷途徑不能夠及時完成DNA損傷的修復過程，DNA的復制叉就會崩塌，形成錯誤的復制叉結構，染色體受到損害或缺失，最后細胞將進入到程控凋亡途徑中。那么，在細胞凋亡的過程中，p12亞基及其他三個亞基將會如何應對？如果p12亞基確實發(fā)生了蛋白酶解，Polδ其他亞基如何

5、參與這個過程？Polδ4到Polδ3是如何轉換的？但到目前為止，還沒有任何關于Polδ參與細胞凋亡過程相關的研究報道。
　　因此，本論文研究通過細胞凋亡誘導試劑或相關誘導藥物等處理宮頸癌細胞(HeLa-S3)，運用Western Blot、細胞凋亡檢測試劑盒、鈣蛋白酶活性檢測試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒、熒光顯微鏡等分析手段和工具，觀察Polδ各亞基在不同凋亡途徑中凋亡早期和凋亡晚期的特征變化，首次探索DNA聚合酶δ在

6、細胞凋亡途徑中的未知功能。
　　其初步實驗結果表明，在鈣離子誘導的HeLa細胞凋亡過程中，p12亞基在凋亡早期首先被酶解，在中期又發(fā)生回復，而在凋亡晚期再次被酶解，具有明顯的時相性;p12亞基在凋亡早期的蛋白酶解可以被蛋白酶抑制劑MG132阻斷，而MG132和Calpain抑制劑ALLN可以同時抑制p12亞基在凋亡晚期的降解。體外實驗表明，Calpain是通過和Polδ的p125、p68、p50三個亞基及PCNA捆綁反應酶解p12