益氣活血化痰通絡法對腦缺血小鼠海馬組織MMP-9、TIMP-1表達的影響.pdf

1、目的:在缺血性腦損傷過程中,基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrixmetalloproteinases-9,MMP-9)通過降解細胞外基質(zhì)(Extracelluar matrix,ECM)成分導致急性期血腦屏障受損或同時加劇細胞凋亡是其重要機制,而基質(zhì)金屬蛋白酶內(nèi)源性抑制劑-1(Tissue inhibitor metalloproteinases-1,TIMP-1)可與MMP-9以1:1的比列特異性結(jié)合而在蛋白水平調(diào)節(jié)MMP-9的活性。本實

2、驗采用組織病理學和免疫組織化學等方法,觀察益氣活血化痰通絡法對小鼠腦缺血再灌注后海馬神經(jīng)元的保護作用,及其對缺血腦組織MMP-9、TIMP-1蛋白表達的影響,研究和探討益氣活血化痰通絡法抗腦缺血損傷作用及其部分機制,以期為臨床應用該法預防和治療腦缺血性疾病提供一定的實驗依據(jù)。
　　 方法:將80只體重為30-40g健康昆明小鼠隨機分為4組:假手術組、模型組、中藥防治組和對照組,每組20只。中藥防治組采用益氣活血化痰通絡復方煎劑(

3、每1ml含1.56g生藥),對照組采用腦血康滴丸水溶劑(每1ml含7mg腦血康滴丸),均按體重1.5ml/100g劑量灌胃,每日一次,假手術組和模型組灌服等量生理鹽水。于第3天灌胃后2h所有小鼠經(jīng)10％水合氯醛350mg/kg腹腔麻醉,仰臥固定于手術臺上,頸部正中切口,鈍性分離肌肉和血管,注意保護迷走神經(jīng),充分暴露雙側(cè)頸總動脈,模型組、中藥防治組和對照組用無創(chuàng)微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈阻斷血流30 min,然后恢復灌流;假手術組只暴露雙側(cè)

4、頸總動脈30min,但不阻斷血流。術中及術后注意保暖,并保證動物自主呼吸,待動物清醒后放回籠中飼養(yǎng),繼續(xù)灌胃同前。術后48h各組隨機選取10只小鼠用10％水合氯醛深度麻醉之后,4％多聚甲醛PBS液灌注固定,然后斷頭取腦,切取視交叉后1-4mm腦片放入4％多聚甲醛繼續(xù)固定48h,石蠟切片,HE染色,光鏡下觀察海馬CA1區(qū)組織學分級、計數(shù)神經(jīng)元密度(neuronal density,ND),并采用免疫組化方法檢測海馬組織MMP-9、TIMP

5、-1蛋白表達。其余小鼠采取相同方法于術后7d采集制作標本,觀測相同指標。
　　 結(jié)果:
　　 1.海馬CA1區(qū)組織病理學改變:
　　 (1)術后48h,與假手術組(ND:211±12n/mm)相比,模型組(ND:184±16n/mm)海馬CA1區(qū)損傷較為明顯(P＜0.05),組織學分級多為1級和2級,而中藥防治組(ND:206±12n/mm)和對照組(ND:204±13n/mm)海馬CA1區(qū)無明顯損傷(P＞0.0

6、5)。
　　 (2)術后7d,與假手術組(ND:215±19n/mm)相比,模型組(ND:87±23n/mm)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度明顯降低(P＜0.01),組織學分級明顯升高(P＜0.01),提示延遲性神經(jīng)元死亡(delayed neuron death,DND)嚴重。與模型組相比,中藥防治組(ND:187±20n/mm)和對照組(ND:182±21n/mm)海馬損傷較輕,CA1區(qū)組織學分級和神經(jīng)元密度均有明顯差異(P＜0.0

7、1或P＜0.05);而中藥防治組和對照組之間無明顯差異(P＞0.05)。
　　 2.海馬CA1區(qū)MMP-9、TIMP-1蛋白表達:
　　 (1)術后48h,假手術組海馬組織可見MMP-9、TIMP-1蛋白微弱表達(MMP-9:0.1392±0.0146;TIMP-1:0.1652±0.0384)。與假手術組相比,模型組(MMP-9:0.2365±0.0130;TIMP-1:0.2198±0.0196)、中藥防治組(MMP

8、-9:0.1971±0.0134:TIMP-1:0.2779±0.0385)和對照組(MMP-9:0.2022±0.0164;TIMP-1:0.2566±0.0264)MMP-9、TIMP-1表達均明顯增強(P＜0.01或P＜0.05)。與模型組相比,中藥防治組和對照組MMP-9表達明顯減少、TIMP-1表達明顯增多(P＜0.01或P＜0.05),而后兩組之間MMP-9、TIMP-1表達無明顯差異(P＞0.05)。
　　 (2)

9、術后7d,與假手術組(MMP-9:0.1482±0.0123;TIMP-1:0.1667±0.0338)相比,模型組MMP-9(0.2150±0.0132)表達明顯增多(P＜0.01),TIMP-1(0.1870±0.0196)表達亦見增多,但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與模型組相比,中藥防治組(MMP-9:0.1659±0.0053;TIMP-1:0.2618±0.0295)和對照組(MMP-9:0.1712±0.0102;TIMP

10、-1:0.2370±0.0259)MMP-9表達均明顯減少(P＜0.01),TIMP-1表達均明顯增多(P＜0.01),而后兩組之間比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.夾閉小鼠雙側(cè)頸總動脈30min致腦缺血,再灌注48h和7d均可出現(xiàn)海馬組織損傷,以術后7d較為明顯,表現(xiàn)為CA1區(qū)組織學分級升高,錐體神經(jīng)元密度降低,而益氣活血化痰通絡組方可明顯減輕腦缺血引起的海馬組織損傷。
　　 2.益氣活