溫度-pH響應(yīng)型磁性納米凝膠用于大鼠腦膠質(zhì)瘤MRI-熒光成像的研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，具有較高的惡性程度和死亡率，且其對(duì)腦功能的破壞導(dǎo)致嚴(yán)重的認(rèn)知和情感障礙。目前手術(shù)仍是首選治療方法。但由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞彌漫浸潤性的生長，手術(shù)中難以區(qū)分正常腦組織和腫瘤組織，經(jīng)常造成術(shù)后殘留腫瘤的復(fù)發(fā)，或者正常腦組織功能的喪失。完整切除腫瘤且不影響瘤床附近的腦關(guān)鍵結(jié)構(gòu)是腦膠質(zhì)瘤瘤手術(shù)的理想結(jié)果，其中的關(guān)鍵問題是如何對(duì)腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行清晰準(zhǔn)確的界定。為了在術(shù)前對(duì)腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行準(zhǔn)確定位和精細(xì)成像并在術(shù)中引導(dǎo)外科醫(yī)生區(qū)分正常

2、腦組織和腫瘤組織來提高腫瘤切除的精度，本研究利用聚（N-異丙基丙烯酰胺-co-丙烯酸）（PNA）納米凝膠的溫度/pH響應(yīng)性，負(fù)載Fe3O4納米材料，并偶聯(lián)腦腫瘤靶向配體（乳鐵蛋白）和近紅外熒光染料（Cy5.5）。對(duì)所構(gòu)建的Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的理化性質(zhì)、磁性能及MRI/光學(xué)成像性能進(jìn)行了表征與評(píng)價(jià)；通過研究 Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的血清蛋白調(diào)理作用、巨噬細(xì)胞的吞噬行為、體內(nèi)血液循環(huán)過程、溫度/pH響應(yīng)性以及Lf

3、主動(dòng)靶向性對(duì)細(xì)胞攝取的影響，對(duì)Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的體內(nèi)過程進(jìn)行了初步探討；從體外成像和體內(nèi)成像兩方面考察了Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠對(duì)大鼠原位腦膠質(zhì)瘤的特異性成像特性；并分別考察了Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的體外和體內(nèi)毒性。研究中完成的主要工作包括：
　　(1)制備了Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠并對(duì)其進(jìn)行表征。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法證實(shí)了Cy5.5-Lf偶聯(lián)至 MPNA納米凝膠。Cy5.

4、5-Lf-MPNA納米凝膠的平均粒徑為86.4±3.4nm（TEM），流體力學(xué)直徑為95.5±6.2nm，PDI為0.186，原子吸收光譜及熱重分析測定納米凝膠中 Fe3O4含量為38.7％。振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)（VSM）測定Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的磁飽和強(qiáng)度為61.1emu/g Fe。醫(yī)用磁共振成像儀（MRI，3T）測定其弛豫率（r2）為129.3mM-1s-1。納米凝膠在695nm處具有最大發(fā)射峰。采用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）和疏

5、水熒光探針（芘）技術(shù)對(duì)其粒徑、表面親疏水性隨溫度及pH的變化進(jìn)行了表征。其粒徑隨溫度升高而降低，疏水性隨著溫度升高而增大，pH6.8時(shí)，體積相轉(zhuǎn)變溫度（VPTT）約為34℃， pH7.4時(shí)， VPTT約為40℃。
　　(2)選擇BSA和IgG作為代表性血清蛋白考察Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的蛋白調(diào)理作用。結(jié)果顯示pH7.4時(shí)，Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠表現(xiàn)為高度親水、溶脹，且ζ電位絕對(duì)值較低，BSA和 IgG的吸附

6、水平都較低；但 pH降低至6.8時(shí)， Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷畱B(tài)、粒徑收縮，且ζ電位絕對(duì)值增大，導(dǎo)致BSA和IgG的吸附水平顯著升高。而對(duì)照組材料Cy5.5-Lf-SPION不具有pH響應(yīng)性，兩個(gè)pH條件下BSA和IgG的吸附水平?jīng)]有顯著性差異。此外，pH7.4下，Cy5.5-Lf-SPION和Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的粒徑存在顯著性差異，且Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠表面具有高度柔性的納米凝膠層，具

7、有良好的變形性，在正常生理環(huán)境中表現(xiàn)為溶脹狀態(tài)，向外高度伸展，故其三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以有效阻礙蛋白與納米材料的接觸，所以與Cy5.5-Lf-SPION相比，BSA和IgG對(duì)Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的吸附水平較低。
　　(3)在巨噬細(xì)胞吞噬行為研究中，將Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠及對(duì)照材料用小鼠血清進(jìn)行調(diào)理后，pH7.4時(shí)，巨噬細(xì)胞對(duì)Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的吞噬量為41.6μg Fe/106細(xì)胞，顯著低于對(duì)

8、Cy5.5-Lf-SPION的吞噬量（59.2μg Fe/106細(xì)胞），其結(jié)果與蛋白調(diào)理作用的研究結(jié)果相符。
　　(4)在溫度/pH響應(yīng)性對(duì)細(xì)胞攝取的影響的研究中，不同 pH條件下，C6細(xì)胞和ECV304細(xì)胞對(duì)Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的攝取都存在顯著性差異。pH6.8時(shí)，細(xì)胞攝取量顯著高于pH7.4下的攝取量。其中C6細(xì)胞對(duì)Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的攝取增加了30％，ECV304細(xì)胞對(duì)Cy5.5-Lf-MPNA

9、納米凝膠的攝取增加了50％。而對(duì)于不具有溫度/pH響應(yīng)性的Cy5.5-Lf-SPION和SPION，不同pH條件下，兩種細(xì)胞對(duì)材料的攝取量沒有明顯差異。
　　(5)在Lf偶聯(lián)對(duì)細(xì)胞攝取的影響研究中，C6細(xì)胞（LRP1表達(dá)陽性）在孵育濃度范圍（0-20μg Fe/mL）內(nèi)對(duì)Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的攝取量顯著高于 MPNA納米凝膠，且在較大濃度時(shí)，差異非常顯著（孵育濃度為15和20μg Fe/mL時(shí)，p <0.0

10、01）。而 ECV304細(xì)胞(LRP1表達(dá)陰性）在相同孵育濃度范圍內(nèi)對(duì)Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的攝取量與對(duì)MPNA納米凝膠的攝取量無顯著差異（p>0.05）。進(jìn)一步證實(shí)了Lf靶向修飾可以提高 LRP1陽性細(xì)胞對(duì)偶聯(lián) Lf納米材料的攝取量。
　　(6)初步探討了Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的體內(nèi)靶向過程。Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠進(jìn)入體內(nèi)后，在正常組織（血液）中是溶脹的親水狀態(tài)，ζ電位呈負(fù)值且絕對(duì)值較小，具備

11、長循環(huán)能力。到達(dá)腫瘤部位后，由于環(huán)境pH降低（pH6.5-6.8），Cy5.5-Lf-MPNA轉(zhuǎn)變?yōu)槭湛s的疏水狀態(tài)，這種改變以及靶向分子Lf的存在，有助于促進(jìn)EPR效應(yīng)并增強(qiáng)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的相互作用。
　　(7) MRI/熒光成像方法考察Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠對(duì)腦膠質(zhì)瘤的特異性成像能力。結(jié)果表明，C6細(xì)胞可吞噬Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠，且Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠位于細(xì)胞漿；注射Cy5.5-Lf-MPN

12、A納米凝膠后荷瘤大鼠腫瘤部位信號(hào)降低，而注射 MPNA納米凝膠無任何肉眼可見的信號(hào)變化，且注射Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的腫瘤部位信號(hào)最大變化為82％；注射Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的荷瘤大鼠腫瘤部位觀察到明顯的熒光信號(hào)，且熒光信號(hào)勾勒出清晰的腦膠質(zhì)瘤區(qū)域；注射Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的荷瘤大鼠腫瘤組織中累積了大量可被普魯士藍(lán)染成藍(lán)色的鐵顆粒，而注射MPNA納米凝膠的荷瘤大鼠腫瘤組織中僅存在少量鐵顆粒；原子吸收

13、光譜（AAS）方法證實(shí)注射Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠后，荷瘤大鼠腫瘤組織的Fe含量高于注射生理鹽水和MPNA納米凝膠的荷瘤大鼠腫瘤組織的Fe含量，進(jìn)一步證實(shí)了Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠對(duì)膠質(zhì)瘤的選擇性。
　　(8)對(duì)Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的體外和體內(nèi)毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。噻唑藍(lán)（MTT）的結(jié)果顯示在0-100μg/mL濃度范圍內(nèi)，MPNA納米凝膠和Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠對(duì)兩種正常細(xì)胞（HEK293

14、細(xì)胞和 NIH/3T3細(xì)胞）的存活率沒有明顯影響。體內(nèi)毒性結(jié)果顯示，注射 MPNA納米凝膠和Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠后，正常大鼠各生化指標(biāo)，包括谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）和各血液功能指標(biāo)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血紅蛋白濃度（HGB）和血小板計(jì)數(shù)（PLT）均未出現(xiàn)明顯異常。組織病理學(xué)結(jié)果顯示采集的心、肝、脾、肺、腎及腦

15、組織的結(jié)構(gòu)均未發(fā)生明顯變化。
　　綜上所述，Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠具有降低血漿蛋白調(diào)理和巨噬細(xì)胞吞噬、延長血漿半衰期，增強(qiáng)向腫瘤組織聚集的能力（被動(dòng)靶向），同時(shí)結(jié)合 Lf對(duì)腦腫瘤的受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用（主動(dòng)靶向），可選擇性提高腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)其的攝取能力。Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的MRI/熒光成像的體內(nèi)外研究表明其將SPION的MRI成像能力和近紅外熒光染料的光學(xué)成像能力有機(jī)地結(jié)合起來，具有良好的生物安全性，有望發(fā)