人骨髓干細胞源性惡性轉(zhuǎn)化細胞的靶向清除.pdf

1、背景：人類骨髓干細胞human bone marrow stem cells，hBMSC)移植給許多病人帶來了希望的同時也帶來了風險。干細胞治療所帶來的所有風險中，最嚴重而且最引人注目的是干細胞植入體內(nèi)后發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化而致腫瘤的形成。因而制定一個干細胞植入后的可控制策略就成了各干細胞研究團隊和臨床醫(yī)學研究者迫在眉睫要解決的問題。然而，制定這樣的策略卻不可避免地面臨著許多挑戰(zhàn)，包括高效腫瘤組織特特異性啟動子的設計、獲取大量hBMSC源性惡轉(zhuǎn)

2、細胞用于啟動子的功能驗證及體內(nèi)外細胞毒性實驗、惡性轉(zhuǎn)化細胞異種移植成活率較低等。迄今為止仍然沒有一個切實可行的方法來預防移入hBMSC發(fā)生致瘤性轉(zhuǎn)化。
　　 目的：1.提高端粒酶啟動子在hBMSC源性惡性轉(zhuǎn)化細胞靶向轉(zhuǎn)錄活性的順式修飾探討，獲取一種在端粒酶陽性細胞中具有高特異性和較強轉(zhuǎn)錄活性的hTERT啟動子，為下一步預防干細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化及靶向清除植入hBMSC源性惡性轉(zhuǎn)化細胞打下基礎；2.探尋一個在體外獲取足夠數(shù)量hBMSC

3、源性惡性轉(zhuǎn)化細胞的方法；3.建立一個為預防植入hBMSC發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化以及靶向清除發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化研究模型。
　　 方法：
　　 1.c-Myc結合元件對hTERT啟動子的修飾：用化學合成方法在野生型hTERT(WThTERT)核心啟動子片段(編碼蛋白起始子ATG上游-268 bp～-10 bp)的3'端接入三個E-box序列，構建成修飾型hTERT[Mod1hTERT)啟動子；分別用WThTERT和Mod1hTERT啟動子去

4、調(diào)控增強型綠色熒光蛋白(EGFP)及熒光素酶報告基因在293FT、HepGⅡ、SGC7901、U2OS(端粒酶陰性)、以及人骨髓干細胞(hBMSC)中表達，比較并分析不同啟動子在端粒酶陽性與陰性細胞中的表達強度。
　　 2.源于hBMSC的惡性轉(zhuǎn)化細胞的體外擴增：從骨髓中分離培養(yǎng)人骨髓干細胞，并用流式細胞儀進行表型鑒定；然后用慢病毒轉(zhuǎn)染和致瘤化學誘導劑BPDE處理共同誘導骨髓干細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化；用PALA進行IC50篩選純化瘤變

5、細胞克??；最后再用PCR、RT-PCR、Western blot等方法對慢病毒轉(zhuǎn)染、細胞周期調(diào)控相關基因表達進行分析。
　　 3.下調(diào)hTERT啟動子在hBMSC中轉(zhuǎn)錄活性的修飾：在Mod1hTERT啟動子的上游接入4個骨髓鋅指蛋白-2(MZF-2)轉(zhuǎn)錄因子結合元件，形成新的修飾型啟動子命名為Mod2hTERT啟動子；分別從大腸桿菌K12和質(zhì)粒pEGFP-N3中通過聚合酶鏈式反應合成胞嘧啶轉(zhuǎn)氨酶(CD)基因和綠色熒光蛋白(EGF

6、P)基因；用化學合成法分別制備野生型hTERT、Mod1hTERT及Mod2hTERT啟動子；將EGFP和熒光素酶(luciferase)報告基因分別亞克隆入慢病毒載體pLenti6/V5-D-TOP中；將各啟動子片段取代pLenti6/V5-D-TOPO中的CMV啟動子片段；將重組慢病毒載體包裝成病毒顆粒后轉(zhuǎn)染正常人骨髓間充質(zhì)干細胞(hBMSC)、慢病毒轉(zhuǎn)染及化學致瘤劑BPDE處理后的人骨髓間充質(zhì)干細胞(BR-hBMSC)，以及PAL

7、A抗性的BR-hBMSC(PBR-hBMSC)；通過熒光相差顯微鏡觀察EGFP表達和熒光素酶分析kit檢測熒光素酶活性(luciferase activity)。
　　 4.5-FC對hBMSC源性惡性轉(zhuǎn)化細胞的細胞毒性實驗：分別用不同濃度梯度的5-FC來處理體外培養(yǎng)的轉(zhuǎn)入 WThTERT-luciferase-IRES-CD、Mod1hTERT-luciferase-IRES-CD、Mod2hTERT-luciferase-I

8、RES-CD、CMV-luciferase-IRES-CD及prmoter(lack)-luciferase-IRES-CD融合基因的各組PBR-hBMSC細胞；用MTT法在體外測定不同濃度梯度5-FC對各組PBR-hBMSC的細胞毒性；轉(zhuǎn)入WThTERT-luciferase-IRES-CD、Mod2hTERT-luciferase-IRES-CD、以及CMV-luciferase-IRES-CD的轉(zhuǎn)基因PBR-hBMSC植入裸鼠的皮

9、下一周后，腹腔注射5-FC5 mg/天，并用活體熒光成像系統(tǒng)對植入細胞的生長狀況進行觀測。
　　 結果：
　　 1.c-Myc結合元件對hTERT啟動子的修飾：在Mod1hTERT啟動子的各實驗組細胞中，能夠在端粒酶陽性的293FT、HepGⅡ及SGC7901細胞組中觀測到EGFP的表達，而在端粒酶陰性的U2OS及hBMSC細胞組中沒有觀測到EGFP的表達；進一步用熒光素酶活性對啟動子的轉(zhuǎn)錄活性進行定量分析表明，在端粒酶

10、陽性的293FT、HepGⅡ、SGC7901和U2OS細胞株中，Mod1hTERT啟動子調(diào)控下的熒光素酶活性要高于WThTERT啟動子組(P<0.01)，而在端粒酶陰性的原代人成纖維細胞hBMSC及骨肉瘤細胞U2OS細胞中，Mod1hTERT啟動子與WThTERT啟動子的轉(zhuǎn)錄活性無顯著性差別(P>0.05)。
　　 2.源于hBMSC惡性轉(zhuǎn)化細胞的體外擴增：PCR結果表明，hBMSC在慢病毒介導下可以獲得外源的遺傳性表型；RT-

11、PCR檢測結果表明，細胞周期調(diào)控相關基因c-myc、bcl-2表達顯著上調(diào)(p<0.01)，p53及mzf-2則顯著下調(diào)(p<0.01)。
　　 3.下調(diào)hTERT啟動子在hBMSC中轉(zhuǎn)錄活性的修飾：通過熒光相差顯微鏡觀察結果表明，啟動子Mod1hTERT和Mod2hTERT在PBR-hBMSC(慢病毒轉(zhuǎn)染、BPDE處理后，具有PALA抗性的hBMSC)中的表達較強而在hBMSC和BR-hBMSC(慢病毒轉(zhuǎn)染hBMSC)中只有微

12、弱的表達；啟動子CMV驅(qū)動的EGFP基因在所有的細胞中都有很強的表達；Luciferase activity分析結果表明，在293FT及PBR-hBMSC細胞中，Mod1hTERT及Mod2hTERT啟動子的轉(zhuǎn)錄活性要顯著高于WT-hTERT啟動子的轉(zhuǎn)錄活性(Sig.<0.05)，而在hBMSC及BR-hBMSC(慢病毒轉(zhuǎn)染hBMSC)中，Mod2hTERT的轉(zhuǎn)錄活性得到了有效的抑制(Sig.<0.05)。
　　 4.5-FC對

13、hBMSC源性惡性轉(zhuǎn)化細胞的細胞毒性實驗：MTT實驗結果表明，當5-FC濃度100μM時，在Mod1hTERT細胞組中存活細胞占5.79％，Mod2hTERT細胞組中占6.53％，CMV細胞組中只有1.97％的細胞存活；而在相同條件下實驗陰性對照組prmoter(lack)-luciferase-IRES-CD中，存活的細胞達到96.27％；活體熒光成像系統(tǒng)檢測結果表明，在給藥時間為O周時WThTERT-luciferase-IRES-

14、CD細胞組的最大熒光信號比Mod2-luciferase-IRES-CD細胞組及CMV-luciferase-IRES-CD細胞組低4.33及5.29倍；而給藥2至此周后，各組間的熒光信號強度差異不顯著。給藥4至周后，Mod2-luciferase-IRES-CD細胞組及CMV-luciferase-IRES-CD細胞組的熒光信號基本消失，WThTERT-luciferase-IRES-CD細胞組的熒光信號仍然存在。
　　 結論

15、：
　　 1.在hTERT核心啟動子的3'端增加E-box元件的數(shù)量可以提高hTERT核心啟動子序列的腫瘤靶向轉(zhuǎn)錄活性。
　　 2.hBMSC在BPDE和慢病毒共同誘導后，用PALA的IC50篩選可以得到瘤變細胞克隆。
　　 3.野生型hTERT啟動子經(jīng)過c-Myc作用元件E-box進行修飾后，可以有效提高hTERT啟動子在端粒酶陽性細胞中的轉(zhuǎn)錄活性.而經(jīng)過修飾MZF-2結合位點修飾后，可以有效降低hTERT啟動