介導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的新信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白及骨髓瘤骨病新治療靶點的初步探索.pdf

1、目的：多發(fā)性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）患者RANKL表達(dá)異常增高使RANKL/RANK信號系統(tǒng)過度激活，導(dǎo)致破骨細(xì)胞（Osteoclast，OC）大量生成且功能亢進(jìn)在骨髓瘤骨病（Myeloma bone disease，MBD）的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用，因此抑制RANKL/RANK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而抑制OC的形成及其破骨功能是治療MBD有效方法之一。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)RANK蛋白上存在一個新基序：IVVY，介導(dǎo)了一條

2、OC形成所必需的新信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本研究的目的就是要利用這個全新的RANK基序，尋找和鑒定出與新基序IVVY相互作用而且介導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的、目前尚未知的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，以進(jìn)一步揭示RANKL/RANK系統(tǒng)激活引起破骨細(xì)胞形成的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（signaling pathway）。那么，這一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白很大可能就是 MBD等骨病的特異性治療靶點，為研究和開發(fā)治療MBD特異性靶向藥物奠定基礎(chǔ)。
　　方法：⑴采用Gat

3、eway技術(shù)構(gòu)建適合酵母表達(dá)的小鼠巨噬細(xì)胞cDNA文庫并進(jìn)行鑒定。⑵酵母雙雜交實驗掃庫以篩選與IVVY相互作用的候選下游信號蛋白。⑶與IVVY相互作用的候選蛋白在破骨細(xì)胞中表達(dá)情況驗證。用Western Blotting技術(shù)和激光共聚焦掃描顯微鏡檢測相應(yīng)蛋白表達(dá)的定量、定位及其動態(tài)分析。⑷分別利用酵母雙雜交和免疫共沉淀（coimmunoprecipitation, coIP）實驗在酵母細(xì)胞和哺乳細(xì)胞293T中驗證上述篩選到的候選蛋白與誘

4、餌蛋白Bait之間的相互作用；另外，將誘餌蛋白Bait上的IVVY基序突變成IVAF以形成突變體Bait，再重復(fù)上述酵母雙雜交和coIP實驗，來證明候選蛋白是經(jīng)IVVY基序與RANK相互作用。⑸利用RNAi技術(shù)抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)這一候選蛋白的表達(dá)，以及siRNA解救技術(shù)抵消這一 RNAi作用，觀察這一蛋白被抑制后及解救后的巨噬細(xì)胞形成破骨細(xì)胞的能力和水平，從而考察這一蛋白是否具有介導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的功能，從功能上進(jìn)一步證實這一與IVVY基序相

5、互作用的蛋白為介導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的IVVY基序下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。⑹利用coIP、ChIP、siRNA及其解救技術(shù)來鑒定 RYBP上介導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域，以及RYBP介導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。
　　結(jié)果：①文庫總滴度達(dá)到3.9×107，酶切分析24個克隆，23個（95.83％）克隆有肯定的基因插入片段，插入片段大小范圍為0.2-5.6Kb，平均為2.27 Kb，證實此BMMs cDNA表達(dá)型文庫質(zhì)量高，達(dá)到

6、標(biāo)準(zhǔn)文庫的要求。②3輪酵母雙雜交試驗，篩得10個陽性克隆的質(zhì)粒，經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)，其中有6個是相同的，其基因庫編號（GB）是BC080287，編碼Ring1和YY1結(jié)合蛋白（Ring1 and YY1-binding protein，RYBP），其出現(xiàn)的幾率最高，意味著它是可能性最大的候選蛋白。另外3個篩選到的蛋白為：編碼ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette）、編碼E2F轉(zhuǎn)錄因子（E2F transcription fa

7、ctor)和熱休克蛋白8(heat shock protein8)的基因。而且，回頭檢查實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，表達(dá)RYBP蛋白的陽性克隆出現(xiàn)也最快。③在M-CSF和RANKL的刺激下，在骨髓巨噬細(xì)胞（BMMs）向破骨細(xì)胞分化過程中，Western Blotting檢測細(xì)胞內(nèi)RYBP的表達(dá)量變化不大，但激光共聚焦掃描發(fā)現(xiàn)RYBP出現(xiàn)一個“從細(xì)胞核移動到細(xì)胞膜再又回到細(xì)胞核”的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移過程，提示RYBP在破骨細(xì)胞形成過程中發(fā)生著變化，很可能與破

8、骨細(xì)胞形成密切相關(guān)。④表達(dá)候選蛋白RYBP的AD-RYBP質(zhì)粒與BD-Bait質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化AH109酵母進(jìn)行雙雜交實驗，不僅出現(xiàn)陽性克隆再次驗證這兩種蛋白的相互作用，即使將AD-RYBP質(zhì)粒較常規(guī)稀釋1000倍，仍能檢測到蛋白之間的相互作用。⑤RYBP與Bait蛋白之間有相互作用（有共沉淀），但與Bait蛋白突變體之間無相互作用（無共沉淀），說明RYBP蛋白是經(jīng)過IVVY基序與Bait（或者RANK）蛋白相互作用。⑥siRNA成功地沉默小

9、鼠BMMs細(xì)胞RYBP蛋白，而沉默了RYBP蛋白的BMMs細(xì)胞形成破骨細(xì)胞的能力明顯降低，siRNA解救技術(shù)成功解救RYBP-siRNA對破骨細(xì)胞形成的抑制作用。⑦鑒定出RYBP上介導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其功能結(jié)構(gòu)域以及RYBP介導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的表觀遺傳學(xué)機(jī)制研究仍在進(jìn)行當(dāng)中。
　　結(jié)論：本研究在先前發(fā)現(xiàn)RANK蛋白上新基序IVVY的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建巨噬細(xì)胞的酵母表達(dá)cDNA文庫，再利用酵母雙雜交、免疫沉淀、免疫熒光、RNA