以PPARγ-RXRα為靶點(diǎn)治療多發(fā)性骨髓瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、PPARγ配體羅格列酮與全反式維甲酸對(duì)骨髓瘤細(xì)胞株生長(zhǎng)和調(diào)亡的影響及其機(jī)制的研究 目的:觀察過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)的人工配體羅格列酮(RGZ)與全反式維甲酸(ATRA)在體外對(duì)骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響并進(jìn)一步研究其可能的作用機(jī)制。 方法:人骨髓瘤細(xì)胞U266和RPMI-8226以RGZ、ATRA干預(yù)后，采用3H-TdR摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化；MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力變化；Annexin-V/PI雙染

2、和TUNEL方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化；用半定量RT-PCR方法檢測(cè)凋亡抑制蛋白FLIP、XIAP及survivin mRNA表達(dá)變化；采用熒光CaspACETM試劑盒檢測(cè)caspas-3活性變化。 結(jié)果:RGZ對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的增殖抑制作用與RGZ的劑量直線相關(guān)，與RGZ單用組比較，ATRA與RGZ聯(lián)合對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的增殖抑制作用更明顯；用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力變化時(shí)觀察到，RGZ對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的活力產(chǎn)生了相似的抑制作用，并呈劑量、時(shí)間依賴

3、性，ATRA與RGZ聯(lián)合應(yīng)用時(shí)能顯著增強(qiáng)RGZ對(duì)骨髓瘤細(xì)胞活力抑制作用；TUNEL標(biāo)記后熒光顯微鏡下觀察到，用5μmol/LRGZ處理后，U266細(xì)胞內(nèi)即出現(xiàn)綠色熒光斑點(diǎn)，凋亡指數(shù)為(10．4±2．6)％。隨著RGZ濃度的增加，凋亡指數(shù)也增加，以10μmol/L的RGZ培養(yǎng)48h后能誘導(dǎo)(28．6±7．7)％的U266細(xì)胞發(fā)生凋亡，而在ATRA單獨(dú)培養(yǎng)組，未觀察到顯著的綠色熒光斑點(diǎn)，培養(yǎng)液中聯(lián)合加入RGZ和ATRA后，凋亡細(xì)胞的比例較相

4、應(yīng)的RGZ單獨(dú)處理組明顯升高；Annexin-V/PI雙染后流式細(xì)胞儀檢測(cè)也證實(shí)RGZ能誘導(dǎo)U266細(xì)胞和RPMI8226細(xì)胞發(fā)生凋亡，且誘導(dǎo)凋亡作用呈時(shí)間、劑量依賴性，ATRA與RGZ聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，凋亡細(xì)胞的比例較相應(yīng)的RGZ單獨(dú)處理組顯著升高；RT-PCR方法檢測(cè)顯示，RGZ能抑制FLIP、XIAP及survivin mRNA的表達(dá)，ATRA能協(xié)同RGZ進(jìn)一步抑制FLIP、XIAP及survivin的mRNA的表達(dá)；經(jīng)RGZ處理骨髓瘤

5、細(xì)胞的caspase-3活性顯著增加，RGZ與ATRA聯(lián)合處理后caspase-3活性較RGZ處理組顯著增加。 結(jié)論:RGZ能通過(guò)抑制FLIP、XIAP及survivin的表達(dá)、促進(jìn)caspas-3的活化從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制骨髓瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。ATRA能增強(qiáng)RGZ對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的上述作用，兩者聯(lián)合具有協(xié)同效應(yīng)。 二、RGZ與ATRA對(duì)骨髓瘤細(xì)胞分化的影響及其機(jī)制的研究 目的:研究過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ(

6、PPARγ)的配體羅格列酮(RGZ)與全反式維甲酸(ATRA)對(duì)骨髓瘤細(xì)胞分化的影響及其可能機(jī)制。 方法:人骨髓瘤細(xì)胞U266和RPMI-8226以RGZ、ATRA干預(yù)后，用PI染色分析細(xì)胞周期變化；瑞氏．姬母薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞儀分析CD49e表達(dá)變化；用N Antisera to Human Immunoglobulin/L-Chains試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清中輕鏈的含量，Western blot方法檢測(cè)p27Ki

7、p1、p21Waf1表達(dá)變化。 結(jié)果:經(jīng)RGZ培養(yǎng)后，骨髓瘤細(xì)胞的G0/G1期比例較對(duì)照組顯著增加，G2/M和S期細(xì)胞的比例則相應(yīng)減少，ATRA與RGZ聯(lián)合應(yīng)用使細(xì)胞周期停滯的作用更加顯著；經(jīng)RGZ處理后，骨髓瘤細(xì)胞表面CD49e的表達(dá)率增加，形態(tài)學(xué)變化也符合骨髓瘤細(xì)胞分化成熟的規(guī)律，RGZ與ATRA的聯(lián)合應(yīng)用能使骨髓瘤細(xì)胞分化成熟的形態(tài)學(xué)變化和CD49e的表達(dá)增加更加明顯；與對(duì)照組相比，U266細(xì)胞與RPMI-8226細(xì)胞經(jīng)A

8、TRA培養(yǎng)后，蛋白的的分泌量無(wú)顯著增加。以RGZ培養(yǎng)后，U266細(xì)胞與RPMI-8226細(xì)胞的培養(yǎng)上清中輕鏈蛋白的濃度分別達(dá)到(548．3±28．1)ng/ml和(378．4±25．6)ng/ml，較對(duì)照組均顯著增加，在培養(yǎng)液中同時(shí)加入ATRA與RGZ后，培養(yǎng)上清中輕鏈蛋白的含量較RGZ單獨(dú)處理組增加更為明顯。 結(jié)論:RGZ可能通過(guò)上調(diào)p27Kip1、p21Waf1蛋白的表達(dá)介導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞的周期停滯并誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞分化、抑制骨髓

9、瘤細(xì)胞增殖。ATRA能增強(qiáng)RGZ對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的上述作用，兩者聯(lián)合具有協(xié)同效應(yīng)。 三、羅格列酮與全反式維甲酸對(duì)原代骨髓瘤細(xì)胞凋亡和分化的影響 目的:觀察RGZ及ATRA對(duì)骨髓瘤患者原代骨髓瘤細(xì)胞的影響。 方法:采用Mini MRCS系統(tǒng)(Miltemyi Biotec，德國(guó))陽(yáng)性分離純化法分離5例初治MM患者骨髓中CD138+細(xì)胞。獲得的CD138+細(xì)胞經(jīng)RGZ、RGZ+ATRA處理后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖和活性

10、、瑞氏-姬母薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、用Annexin V-FITC/PI標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化、CD49e-FITC單抗標(biāo)記細(xì)胞表面分化抗原CD49e檢測(cè)、用N Antisera to Human Immunoglobulin/L-Chains試劑盒檢測(cè)各樣本中κ及λ輕鏈的含量。 結(jié)果:原代骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)10μmol/L RGZ培養(yǎng)48后，細(xì)胞的活力為66．3％，較對(duì)照組顯著降低。原代骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)1μmol/L ATRA培養(yǎng)后，細(xì)

11、胞的活力為87．5％，較對(duì)照組降低，但差異無(wú)顯著性。當(dāng)1μmol/L ATRA與10μmol/LRGZ聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，RGZ能顯著增強(qiáng)RGZ對(duì)骨髓瘤細(xì)胞活力的抑制作用；原代骨髓瘤細(xì)胞以1μmol/L ATRA單獨(dú)培養(yǎng)72小時(shí)后，骨髓瘤細(xì)胞在形態(tài)上仍比較原始，較對(duì)照組無(wú)明顯改變，經(jīng)10μmol/L RGZ處理的原代骨髓瘤細(xì)胞在形態(tài)上出現(xiàn)了分化和凋亡的改變，當(dāng)ATRA與RGZ聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，類似的形態(tài)學(xué)改變更加明顯；5例患者的原代骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)1μm

12、ol/L ATRA培養(yǎng)48小時(shí)后，細(xì)胞凋亡的比例較對(duì)照組差異無(wú)顯著性，經(jīng)10μmol/L RGZ培養(yǎng)48h后，發(fā)生凋亡的比例較對(duì)照組明顯增加，在培養(yǎng)液中聯(lián)合加入ATRA后，凋亡細(xì)胞的比例較相應(yīng)的RGZ單獨(dú)處理組明顯升高，達(dá)58．4±11．2％；ATRA對(duì)原代骨髓瘤細(xì)胞表面的CD49e表達(dá)較對(duì)照組無(wú)明顯增加，以10μM RGZ培養(yǎng)72小時(shí)后，原代骨髓瘤細(xì)胞表面CD49e的表達(dá)率為(14．3±3．2)％，較對(duì)照組均明顯上調(diào)，ATRA與RGZ

13、聯(lián)合使用時(shí)，原代骨髓瘤細(xì)胞CD49e表達(dá)率的增加較RGZ單獨(dú)處理組更加顯著，達(dá)(24．7±5．7)％；5位初治患者的原代骨髓瘤細(xì)胞以1μmol/L ATRA培養(yǎng)后，原代骨髓瘤細(xì)胞上清中免疫球蛋白輕鏈含量較對(duì)照組無(wú)明顯增加，以10μmol/L RGZ培養(yǎng)后，原代骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清中免疫球蛋白輕鏈含量均較對(duì)照組均明顯上調(diào)，ATRA與RGZ聯(lián)合使用時(shí)，有4位患者(4/5)的原代骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中的免疫球蛋白輕鏈含量較RGZ單獨(dú)處理組更加顯

14、著。 結(jié)論:RGZ能激活原代骨髓瘤細(xì)胞的PPAR7受體，通過(guò)誘導(dǎo)原代骨髓瘤細(xì)胞分化、成熟和凋亡，抑制原代骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，并且在誘導(dǎo)原代骨髓瘤細(xì)胞分化和凋亡的過(guò)程中，ATRA與RGZ也具有協(xié)同效應(yīng)。 四、羅格列酮與全反式維甲酸對(duì)多發(fā)性骨髓瘤血管形成及移植瘤生長(zhǎng)的影響 目的:了解RGZ和ATRA對(duì)骨髓瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)的影響及并觀察RGZ、ATRA對(duì)多發(fā)性骨髓瘤VEGF表達(dá)、移植瘤血管形成的影響。

15、方法:U266、RPMI-8226細(xì)胞以RGZ、ATRA干預(yù)后，用半定量RT-PCR方法分析VEGF的表達(dá)變化；在4周齡Balb/C裸鼠的一側(cè)肩胛部皮下接種0．1ml密度為1×108/ml的U266細(xì)胞，接種一周后分別以RGZ、ATRA腹腔注射干預(yù)，各組連續(xù)給藥21d，第21d脫頸處死裸鼠，剝離皮下腫瘤并稱量；將剝離腫瘤置于10％的中性福爾馬林中固定24h，石蠟包埋、切片，分別作H-E染色和CD34和VEGF免疫組化染色。 結(jié)果

16、:半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，骨髓瘤細(xì)胞系U266與RPMI-8226細(xì)胞均有VEGFmRNA高表達(dá)，U266與RPMI-8226細(xì)胞在經(jīng)5μmol/L RGZ處理24小時(shí)后，VEGF的mRNA的表達(dá)水平均下調(diào)。當(dāng)RGZ濃度的增加至10μmol/L時(shí)，VEGF的mRNA的表達(dá)水平下調(diào)更加明顯，RGZ與ATRA的聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，VEGFmRNA的表達(dá)水平較相應(yīng)的RGZ處理組更加低下；U266細(xì)胞接種后在裸鼠皮下均成瘤，腹腔用藥后，RGZ可

17、明顯抑制骨髓瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)，RGZ處理組的移植瘤的體積和重量分別為785±262mm3和1748±365mg，均顯著低于對(duì)照組，并且ATRA與RGZ聯(lián)合能增強(qiáng)RGZ在裸鼠體內(nèi)對(duì)骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，聯(lián)合處理組的移植瘤的體積和重量分別僅為154±89mm3和626±102mg；HE染色顯示對(duì)照組移植瘤組織內(nèi)瘤細(xì)胞排列密集，間質(zhì)最為豐富，血管生成最多，具有豐富的吻合，RGZ處理組瘤細(xì)胞密度降低、血管生成相對(duì)較少，以RGZ與ATR