PEI-SPIO標(biāo)記關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的可行性研究.pdf

1、背景:關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療一直是運(yùn)動(dòng)損傷領(lǐng)域的重要課題,目前的治療方法除了保守治療外有關(guān)節(jié)腔清理術(shù)、微骨折術(shù)、自體或異體骨軟骨移植術(shù)、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)等多種治療方法,但各治療手段都存在有各自的局限性。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展與成熟,組織工程技術(shù)逐漸應(yīng)用于越來(lái)越多的領(lǐng)域,應(yīng)用于多個(gè)器官組織的損傷修復(fù),自上世紀(jì)90年代,有組織工程技術(shù)應(yīng)用于軟骨損傷修復(fù)的報(bào)道。在這個(gè)研究過(guò)程中,傳統(tǒng)的觀察修復(fù)效果的方法是將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后取實(shí)驗(yàn)部位的組織,進(jìn)行相關(guān)的

2、檢測(cè)和評(píng)定,這樣的方法只能觀察到最終的修復(fù)結(jié)果,無(wú)法動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)在修復(fù)過(guò)程中,種子細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸、遷徙。隨著核磁現(xiàn)象技術(shù)的發(fā)展,SPIO的研制與應(yīng)用,為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的在體識(shí)別和可視化追蹤提供了新的方法。以往的SPIO是Resovist(dm:60nm)和feridex(dm:63nm),都是由葡聚糖包裹的SPIO,表面都呈負(fù)電荷。與細(xì)胞表面的負(fù)電荷相互排斥,使用這種SPIO在標(biāo)記過(guò)程中,標(biāo)記效率低下,需要與轉(zhuǎn)染劑結(jié)合后才能用于標(biāo)記。PEI-SPI

3、O(polyethylenimine-superparamagnetic iron oxid)是由聚乙烯亞胺包被的表面呈正電荷的新型包被材料。由于電荷的吸引,不需要與轉(zhuǎn)染劑結(jié)合,可以大大提高標(biāo)記的效率,同時(shí)聚乙烯亞胺在體內(nèi)的降解時(shí)間也要比葡聚糖時(shí)間長(zhǎng),可以達(dá)到更長(zhǎng)時(shí)間的示蹤。
　　目的:用已經(jīng)掌握的技術(shù)方法,獲取豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定。證實(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞是可以分泌Ⅱ型膠原蛋白以及細(xì)胞外基質(zhì)的透明軟骨細(xì)胞。再用PEI-SPIO對(duì)

4、原代培養(yǎng)的關(guān)節(jié)透明軟骨進(jìn)行標(biāo)記,通過(guò)研究該粒子標(biāo)記細(xì)胞后對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增值、活性和Ⅱ型膠原蛋白基因表達(dá)的影響,研究該粒子標(biāo)記關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的安全濃度和安全標(biāo)記時(shí)間。
　　材料和方法:取1-3月齡的巴馬小香豬后膝關(guān)節(jié)透明軟骨體外培養(yǎng),培養(yǎng)至第2代細(xì)胞,制成細(xì)胞爬片后做PB染色和透射電鏡檢查,然后將PEI-SPIO用培養(yǎng)液配制成Fe濃度為2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/

5、ml的標(biāo)記液,7種濃度的標(biāo)記液分別標(biāo)記的細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)組,不標(biāo)記的細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在培育6、12、18、24、30h后,分別通過(guò)普魯士藍(lán)染色,透射電鏡,細(xì)胞內(nèi)鐵含量,半定量RT-PCR以及WST-1檢測(cè)來(lái)探討材料對(duì)軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響,同時(shí)研究該粒子標(biāo)記關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的安全濃度和安全標(biāo)記時(shí)間。以及通過(guò)將PEI-SPIO移植進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)后對(duì)動(dòng)物重要臟器的損害的研究,來(lái)初步探討該材料的生物安全性。
　　結(jié)果:PB染色顯

6、示,幾乎所有的細(xì)胞都被藍(lán)染,藍(lán)染的部分位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),而細(xì)胞核中均無(wú)藍(lán)染,提示該粒子被細(xì)胞吞噬后位于細(xì)胞的胞質(zhì)中,不存在細(xì)胞核內(nèi)。透射電鏡的結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn),透射電鏡下觀察到大量的黑色致密顆粒位于細(xì)胞的胞質(zhì)中,細(xì)胞核內(nèi)未見(jiàn)黑色致密顆粒。磁標(biāo)記后濃度為6、8、10、12、14μg/ml的實(shí)驗(yàn)組PS染色顯示80％以上的細(xì)胞被鐵粒子標(biāo)記,標(biāo)記率比較高,通過(guò)微量元素檢測(cè)儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)鐵含量的測(cè)定,繪制成曲線發(fā)現(xiàn)SPIO標(biāo)記的時(shí)間越長(zhǎng),細(xì)胞內(nèi)鐵含

7、量越高,在標(biāo)記時(shí)間超過(guò)24h后,各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞內(nèi)鐵含量的曲線就趨向平緩,細(xì)胞內(nèi)鐵含量就就基本不再增加,提示細(xì)胞吞噬標(biāo)記物已經(jīng)達(dá)到了飽和的狀態(tài),即使再增加標(biāo)記的時(shí)間,也無(wú)法提高細(xì)胞內(nèi)鐵含量,無(wú)法提高標(biāo)記效率。WST-1檢測(cè)磁顆粒的細(xì)胞毒性,未標(biāo)記的細(xì)胞為對(duì)照組與標(biāo)記的各個(gè)濃度的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組,標(biāo)記24h后,用分光光度計(jì)測(cè)OD值,最后發(fā)現(xiàn)標(biāo)記24h后各實(shí)驗(yàn)組之間OD值無(wú)顯著差異,(P>0.05);各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間,OD值也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P

8、>0.05)。因此標(biāo)記24h對(duì)于軟骨細(xì)胞來(lái)講,并不會(huì)對(duì)其活性產(chǎn)生影響。進(jìn)一步的研究,對(duì)細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原蛋白的能力進(jìn)行了研究,用6、8μg/ml濃度標(biāo)記的軟骨細(xì)胞,通過(guò)標(biāo)記后測(cè)定半定量的RT-PCR,6μg/ml組中的標(biāo)記組(27.32±1.02)和對(duì)照組(28.56±1.15)的目的條帶灰度值和內(nèi)參條帶灰度值的比值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),而8μg/ml組中標(biāo)記組(13.04±0.60)與對(duì)照組(18.89±1.26)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

9、異(P<0.05),提示6μg/ml的標(biāo)記液標(biāo)記24h后對(duì)透明軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原蛋白基因的表達(dá)無(wú)影響,而8μg/ml的標(biāo)記液標(biāo)記24h后,抑制了透明軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原蛋白基因的表達(dá)。PEI-SPIO移植進(jìn)入體內(nèi)后,重要臟器并未出現(xiàn)明顯的病理?yè)p傷,PEI-SPIO不會(huì)對(duì)重要臟器產(chǎn)生損害。
　　結(jié)論:分離培養(yǎng)出原代的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,而且培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞具有分泌細(xì)胞外基質(zhì)和Ⅱ型膠原蛋白的能力等軟骨細(xì)胞的特性。其次PEI-SPIO可以高效的標(biāo)