TLR9在系統(tǒng)性紅斑狼瘡伴動(dòng)脈粥樣硬化小鼠中對(duì)腎臟損傷的影響.pdf

1、【目的】
　　探討TLR9在系統(tǒng)性紅斑狼瘡伴動(dòng)脈粥樣硬化小鼠中對(duì)腎臟損傷的作用。
　　【方法】
　　本實(shí)驗(yàn)室將降植烷腹腔注射進(jìn)ApoE-/-小鼠，誘導(dǎo)建立系統(tǒng)性紅斑狼瘡伴動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型；并在此基礎(chǔ)上腹腔注射 TLR9抑制劑 IRS869進(jìn)行干預(yù)后，檢測(cè)血清中的抗ds-DNA抗體水平和腎臟組織中的IgG、補(bǔ)體C3、TLR9及TLR9通路分子和VEGF表達(dá)水平。
　　ApoE-/-C57BL/6小鼠和C57BL

2、/6小鼠隨機(jī)分為6組：C57BL/6+生理鹽水對(duì)照組（A組），ApoE-/-+生理鹽水對(duì)照組（B組），C57BL/6+降植烷組（C組），ApoE-/-+降植烷組（D組），C57BL/6+降植烷+IRS869組（E組），ApoE-/-+降植烷+IRS869組（F組）。高脂飲食喂養(yǎng)12周，處死動(dòng)物。取血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)抗ds-DNA；取腎臟組織提取蛋白和RNA分別進(jìn)行 Western Blot和Real-time PCR檢測(cè)TLR9及下

3、游信號(hào)通路分子和VEGF表達(dá)情況；取腎臟組織進(jìn)行石蠟包埋，免疫熒光檢測(cè)IgG和補(bǔ)體C3，Massion染色檢測(cè)腎臟組織纖維化程度。
　　【結(jié)果】
　　1.免疫效應(yīng)指標(biāo)
　　1.1血清抗ds-DNA抗體水平
　　（1）降植烷組血清抗 ds-DNA抗體水平較 C57BL/6對(duì)照組明顯升高（P<0.05），ApoE-/-降植烷組相較 ApoE-/-對(duì)照組明顯升高（P<0.05），ApoE-/-降植烷組與C57BL/6降

4、植烷組差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　?。?）降植烷+IRS869組相較降植烷組明顯下降（P<0.05），ApoE-/-降植烷+IRS869組較ApoE-/-降植烷組明顯下降（P<0.05）。
　　1.2腎臟免疫熒光情況
　　（1）直接免疫熒光顯示降植烷組、ApoE-/-降植烷組 IgG在腎小球系膜毛細(xì)血管袢成明顯連續(xù)性分布，對(duì)照組偶爾可見(jiàn)散在顆粒狀分布，定量分析降植烷組相對(duì)于 C57BL/6對(duì)照組、ApoE-

5、/-降植烷組相對(duì)于 ApoE-/-對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；間接免疫熒光顯示降植烷組、ApoE-/-降植烷組補(bǔ)體C3在腎小球系膜毛細(xì)血管袢成明顯顆粒狀分布，對(duì)照組偶爾可見(jiàn)散在顆粒狀分布，定量分析降植烷組相對(duì)于C57BL/6對(duì)照組、ApoE-/-降植烷組相對(duì)于ApoE-/-對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）注射 TLR9抑制劑后降植烷+IRS869組、ApoE-/-降植烷+IRS869組分別相對(duì)于降植烷組、A

6、poE-/-降植烷組，在腎小球系膜毛細(xì)血管袢上，IgG和補(bǔ)體C3均明顯減少，定量分析差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.TLR9信號(hào)通路各分子表達(dá)
　　2.1腎臟TLR9及下游信號(hào)通路分子蛋白水平表達(dá)情況
　?。?）Western-blot分析，降植烷組、ApoE-/-降植烷組TLR9、MyD88、NF-κB相對(duì)對(duì)照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；ApoE-/-降植烷組TLR9、MyD88、N

7、F-κB蛋白水平相對(duì)于降植烷組相對(duì)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）降植烷+IRS869組、ApoE-/-降植烷+IRS869組TLR9、MyD88、NF-κB的蛋白水平比降植烷組、ApoE-/-降植烷組明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　2.2腎臟TLR9及下游信號(hào)通路分子cDNA水平表達(dá)情況
　　（1）PCR分析，降植

8、烷組TLR9、NF-κB、IRF7、Ⅰ型IFN的cDNA水平比C57BL/6對(duì)照組有升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；ApoE-/-降植烷組TLR9、MyD88、NF-κB、IRF7、Ⅰ型IFN的cDNA水平比對(duì)照組均有明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而ApoE-/-降植烷組相對(duì)于降植烷組在TLR9、MyD88、NF-κB有明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）PCR分析，降植烷+IRS8

9、69組、ApoE-/-降植烷+IRS869組TLR9、MyD88、NF-κB、IRF7、Ⅰ型IFN cDNA水平相對(duì)降植烷組、ApoE-/-降植烷組明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3.腎臟纖維化情況
　　3.1腎臟Massion情況
　　（1）降植烷組、ApoE-/-降植烷組腎臟腎小球膠原纖維相對(duì)于對(duì)照組明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），ApoE-/-降植烷組相對(duì)于降植烷組纖維化程度也有

10、所升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）降植烷+IRS869組、ApoE-/-降植烷+IRS869組腎臟腎小球膠原纖維相對(duì)于降植烷組、ApoE-/-降植烷組明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），和對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異（P>0.05）。
　　3.2 VEGF蛋白水平表達(dá)情況
　?。?）Western-blot分析，降植烷組、ApoE-/-降植烷組VEGF相對(duì)對(duì)照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

11、<0.05）。ApoE-/-降植烷組相對(duì)于降植烷組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）降植烷+IRS869組、ApoE-/-降植烷+IRS869組VEGF的蛋白水平比降植烷組、ApoE-/-降植烷組明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　【結(jié)論】
　　1.降植烷能誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠產(chǎn)生抗ds-DNA抗體，降植烷能與ApoE基