外排轉運蛋白和藥物代謝酶在二萜類化合物生物利用度屏障的作用及其機制.pdf

1、一.研究背景和目的
　　 藥物在體內的吸收與代謝的處置過程中，存在著由外排轉運蛋白和藥物代謝酶共同組成的生物利用度屏障。在生理上，這一生物防御屏障能夠阻礙外來物進入機體內，從而避免機體受到外來物的侵擾，但對于藥物而言，則嚴重影響其藥效與毒性。
　　 二萜類化合物中的毒效成分烏頭生物堿和活性成分穿心蓮內酯在臨床上的使用越來越多。
　　 烏頭生物堿具有局麻、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、強心、抗炎、抗腫瘤等功效。然而由于其治療劑量和中

2、毒劑量非常接近，被中國以及其他一些國家藥典列為大毒藥，在臨床使用過程中，中毒事件頻頻發(fā)生。烏頭在使用前必須經過長時間的煎煮，使毒性成分較大的烏頭堿(AC)、中烏頭堿(MA)、次烏頭堿（HA）大部分水解為毒性較小的苯甲酰烏頭原堿(BAC)、苯甲酰中烏頭原堿(BMA)、苯甲酰次烏頭原堿(BHA)、烏頭原堿(aconine)、中烏頭原堿(mesaconine)和次烏頭原堿。
　　 穿心蓮內酯有降壓、抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗心肌缺

3、血及抗癌等作用。
　　 因此，本研究的目的是基于外排轉運蛋白和藥物代謝酶研究烏頭生物堿和穿心蓮內酯生物利用度屏障特征及分子機制，從而科學地認知穿心蓮內酯的有效性和烏頭生物堿的毒性與生物利用度屏障的關系，趨利避害，增加藥物的療效，減少藥物毒副反應。
　　 二.方法
　　 采用大鼠藥代動力學模型、Caco-2細胞模型、MDR1-MDCK（II）細胞模型，人肝微粒體和S9反應體系，CYP酶單克隆抗體、人源化重組CYP酶

4、、大鼠在體腸灌流模型，高效液相質譜聯用技術，高分辨率質譜，核磁分析技術。
　　 統計學處理:數據用mean±SD來表示。統計軟件SPSS16.0。采用統計方法Students't-test或者One-wayANOVA進行數據分析。
　　 三.結果
　　 1.烏頭生物堿的藥代動力學研究
　　 大鼠灌胃給藥AC,MA和HA后，我們在大鼠血漿里除了檢測到AC，MA和HA，還檢測到BAC，BMA，BHA，acon

5、ine和mesaconine。結果表明AC，MA和HA被水解代謝。AC，MA和HA的消除半衰期(T1/2β)分別是90.8±22.7min,155±66.4min,185±46.2min。BAC,BMA,BHA,aconine和mesaconine的T1/2β分別是526±324min，407±180min，552±142min，685±494min，399±151min。這些結果表明AC，MA和HA在體內的消除比它們的代謝物BAC，B

6、MA，BHA，aconine和mesaconine要快很多，這預示著毒性越大的烏頭生物堿被機體消除的速率越快。
　　 2.AC,MA,HA,BAC,BMA,BHA,aconineandmesaconine在Caco-2和MDR1-MDCK(II)細胞中的轉運
　　 我們研究了烏頭類生物堿1μM在Caco-2細胞中從A(apical)到B(basolateral)方向和從B到A方向的跨膜轉運。AC，MA和HA在Caco-2

7、細胞從A到B方向轉運的表觀滲透系數Papp值分別是(7.63±1.16×10-7)cm/s，(8.24±0.45×10-7)cm/s和(21.5±0.72×10-7)cm/s。而AC，MA和HA從B到A方向轉運的表觀滲透系數Papp值顯著性地高于(P＜0.05）它們從A到B方向的數值。AC，MA和HA的外排轉運率Er值分別是34.6±4.2，29.7±2.1和15.6±2.1。BAC，BMA和BHA在Caco-2細胞從A到B方向轉運的表

8、觀滲透系數Papp值分別是(5.02±1.28×10-7)cm/s，(5.84±2.37×10-7)cm/s和(9.17±1.49×10-7)cm/s。而BAC，BMA和BHA從B到A方向轉運的表觀滲透系數Papp值大約是它們從A到B方向的數值的4倍(P＜0.05）。它們的外排轉運率Er值分別是5.2±1.4，4.5±2.4和4.4±0.9。Aconine和mesaconine在Caco-2細胞從A到B方向轉運的表觀滲透系數Papp值分

9、別是(12.1±3.01×10-7)cm/s和(10.4±2.27×10-7)cm/s。Aconine和mesaconine的外排轉運率Er值分別是1.1±0.4和1.1±0.5。
　　 在cyclosporineA或者verapamil的作用下，AC，MA和HA的外排現象幾乎被完全抑制，外排轉運率Er顯著的降低(P＜0.05），都降低到大約1.0。在這2個化學抑制劑的作用下，BAC，BMA和BHA的Er值都降低;aconine

10、和mesaconine的Er值沒有顯著性變化。與滲透性結果相一致，AC，MA和HA在細胞內的含量，無論從A到B的方向轉運還是從B到A的方向轉運，都顯著地(P＜0.05）增加。在CyclosporineA或者verapamil單獨作用下，從A到B方向轉運，AC在細胞內的含量從2pmol增加到58pmol或者60pmol;MA在細胞內的含量從1pmol增加到44pmol或者45pmol;而HA在細胞內的含量3pmol增加到90pmol或者4

11、4pmol。BAC，BMA和BHA在細胞內的含量，在化學抑制劑的作用下，也相應地有所增加。然而，aconine和mesaconine在細胞內的含量沒有顯著變化。
　　 1μMAC，MA和HA在MDR1-MDCK(II)細胞中從B到A方向的表觀滲透系數顯著地(P＜0.05）大于它們從A到B方向的滲透系數。AC，MA和HA在MDR1-MDCK(II)的外排轉運率Er值顯著地(P＜0.05)大于它們在MDCK(II)細胞中的值，分別是

12、（22.2±2.6）比（1.8±0.5），（27.9±5.3）比（1.5±0.2），（10±1.3）比（1.4±0.3）。在MDR1-MDCK(II)細胞中，BAC，BMA，BHA，aconine和mesaconine的Er值與其在MDCK(II)細胞中的Er值沒有顯著性差異。從A到B方向轉運或從B到A方向轉運，AC，MA和HA在MDR1-MDCK(II)細胞的含量都顯著地小于它們在MDCK(II)細胞的含量（P＜0.05）;而BAC和

13、BHA從B到A方向轉運時，在這兩種細胞內的含量有顯著性變化。從A到B方向轉運或從B到A方向轉運，mesaconine在MDR1-MDCK(II)細胞的含量都顯著地大于它們在MDCK(II)細胞的含量（P＜0.05）。綜合外排轉運率和細胞內含量的變化，我們推斷P-gp參與AC，MA和HA的細胞轉運。
　　 在Ko143的作用下，AC，MA，HA和BAC的Er值顯著地降低(P＜0.05）。在Ko143作用下，從A到B方向轉運，AC在

14、細胞內的含量從2pmol增加到71pmol;MA在細胞內的含量從1pmol增加到47pmol;HA在細胞內的含量從3pmol增加到112pmol;BHA在細胞內的含量也顯著增加;而BAC，BMA，aconine和mesaconine在細胞內的含量沒有顯著變化。綜合外排轉運率和細胞內含量的變化，我們推斷Bcrp可能參與AC，MA和HA的細胞轉運。
　　 在MK571的作用下，AC，MA和HA的Er值顯著的降低(P＜0.05）。BA

15、C，BMA和BHA的Er值也顯著地降低(P＜0.05）。在MK571作用下，從A到B方向轉運，AC在細胞內的含量從2pmol增加到81pmol;MA在細胞內的含量從1pmol增加到48pmol;HA在細胞內的含量從3pmol增加到101pmol。BAC，BMA和BHA在細胞內的含量也顯著增加;而aconine和mesaconine在細胞內的含量沒有顯著變化。綜合外排轉運率和細胞內含量的變化，我們推斷Mrp2可能參與AC、MA、HA、BA

16、C、BMA和BHA的細胞轉運。
　　 3.烏頭生物堿體外CYP酶代謝研究
　　 中烏頭堿在人的肝微粒體中至少生成9個代謝產物(M1～M9)，主要的代謝途徑包括去甲基，脫氫，羥基化，脫氫-去甲基。我們選用了一系列CYP酶亞型的化學抑制劑去確認參與MA代謝的CYP酶亞型。由結果推斷MA的代謝主要是由CYP3A介導，CYP2C8，2C9，2C19和2D6也有一定的作用，CYP1A2和2E1幾乎沒有參與其代謝。接著，我們選用了一

17、系列的人源化重組CYP酶驗證參與MA代謝的CYP酶亞型。在MA的代謝中，CYP3A發(fā)揮著最重要的作用;CYP2C8，2C9，2C19和2D6發(fā)揮部分作用，CYP1A2和2E1的作用很小。
　　 次烏頭堿在人的肝微粒體中至少生成11個代謝產物(M1～M11)，主要的代謝途徑包括去甲基，脫氫，羥基化，脫氫-去甲基，脫二甲基。我們鑒定了代謝產物M8為中烏頭堿?；瘜W抑制劑、單克隆抗體和人源化重組CYP酶實驗表明HA的代謝主要由CYP3A

18、介導。CYP2C19、2D6和2E1在其代謝中也發(fā)揮部分的作用;而CYP1A2和2C8幾乎不參與其代謝。
　　 4.穿心蓮內酯的生物利用度屏障特征
　　 大鼠灌胃給藥穿心蓮內酯120mg/kg，血藥峰濃度Cmax是0.23±0.05μg/mL，達峰的時間是29.75±0.5min;其后，它的消除半衰期時間T1/2β是142.30±34.48min，它的血藥濃度時間曲線下面積AUCo-∞是29.45±3.73μg·min/

19、mL。而大鼠靜脈尾靜脈注射穿心蓮內酯24mg/kg后，它的消除半衰期、清除率，血藥濃度時間曲線下面積分別是157.60±74.09min，109.24±8.99ml/min/kg和220.83±18.26μg·min/mL。因此根據口服生物利用度計算公式，得到穿心蓮內酯的口服生物利用度是2.67％。
　　 為了探索穿心蓮內酯生物利用度低的原因，我們研究了穿心蓮內酯在Caco-2細胞上的雙向轉運。實驗結果表明穿心蓮內酯從B側到A側

20、轉運的表觀滲透系數Papp值(4.94×10-5cm/s)顯著地(P＜0.05)高于其從A側到B側的數值(1.14×10-5cm/s)。穿心蓮內酯的吸收滲透系數Papp值為(1.14×10-5cm/s)，這表明穿心蓮內酯滲透性較高，跨膜容易，吸收差不是造成穿心蓮內酯生物利用度差的原因。
　　 為了進一步研究清楚參與穿心蓮內酯跨膜的外排轉運蛋白，我們選用了MDR1-MDCK(II)細胞研究穿心蓮內酯的跨膜情況。MDR1-MDCK(

21、II)細胞過表達人的mdr-1基因，也就是P-gp。我們同時選用了P-gp表達水平較低的MDCK(II)細胞作為陰性對照。通過比較穿心蓮內酯在這兩種細胞的外排轉運率，確認P-gp對穿心蓮內酯跨膜的作用。穿心蓮內酯在MDR1-MDCK(II)的外排轉運率是其在MDCK(II)細胞的4倍，這表明P-gp介導著穿心蓮內酯的跨膜，能夠把穿心蓮內酯從血漿中外排至腸腔，造成穿心蓮內酯生物利用度低。
　　 腸道酶對穿心蓮內酯有水解作用，其中十

22、二指腸和空腸酶的水解作用較強。特別是在十二指腸中，1h內穿心蓮內脂被水解了約70％，8h內幾乎完全被水解;空腸中，1h內被水解了約50％。而在回腸和結腸中，腸道酶對穿心蓮內酯的水解作用較弱，1h內約10％。
　　 在灌流過程中，穿心蓮內酯在各腸段被吸收的量存在顯著性差異（P＜0.05）。穿心蓮內酯的表觀滲透系數（P*eff是十二指腸＞空腸＞回腸、結腸。由于穿心蓮內酯存在代謝，扣除代謝的部分，其滲透系數有所降低，但其在腸段吸收的趨

23、勢沒有改變，仍然是十二指腸＞空腸＞回腸、結腸。在灌流過程中，穿心蓮內酯經膽汁排泄的總量是39.4nmol，約等于吸收總量的1％。
　　 為了研究清楚穿心蓮內酯在各腸段吸收的差異性，我們在大鼠在體灌流模型中進一步研究了穿心蓮內酯在外排蛋白P-gp的抑制劑維拉帕米和外排轉運蛋白Bcrp的抑制劑雙嘧達莫的作用下的各腸段的吸收。根據參考文獻和抑制劑的半數有效抑制有效濃度，我們選定維拉帕米的灌流濃度為100μM，雙嘧達莫的濃度為50μM，

24、這兩個濃度都遠遠大于它們各自的半數有效抑制濃度。我們采用上述的灌流方法，設定了三組實驗，每組4只大鼠:灌流液分別是穿心蓮內酯(40μM)和維拉帕米(100μM)的混合溶液;穿心蓮內酯(40μM)和雙嘧達莫(50μM)的混合溶液;穿心蓮內酯(40μM)、維拉帕米(100μM)和雙嘧達莫(50μM)的混合溶液。所得的樣品根據上述方法進行分析，結果采用One-wayANOVA的分析方法進行統計。
　　 結果顯示在維拉帕米的作用下，穿心

25、蓮內酯在回腸和結腸中的表觀滲透系數顯著性（P＜0.05）地增加了，但其在十二指腸和空腸中沒有顯著性變化。在雙嘧達莫的作用下，穿心蓮內酯在各腸段的表觀滲透系數沒有顯著性(P＜0.05）變化。然而，在維拉帕米和雙嘧達莫的作用下，穿心蓮內酯在回腸和結腸的表觀滲透系數顯著性(P＜0.01)地增大，但仍然沒有改變其在十二指腸和空腸中的表觀滲透系數，穿心蓮內酯呈腸段吸收依賴性的現象消失了。
　　 在抑制劑的作用下，在灌流60min后，穿心蓮

26、內酯經膽汁排泄的量也大大地(P＜0.05）增加。
　　 在穿心蓮內酯灌流樣品分析中，通過對比空白樣品和含藥灌流樣品，我們在其十二指腸和空腸灌流液中的色譜圖中，發(fā)現了穿心蓮內酯的一個代謝產物，其保留時間是1.91min，通過高分辨質譜(Bruker，USA)測得它的精確分子量是413.1657，根據精確分子量推測得到的分子式是C20H29O7S。我們把十二指腸和空腸的灌流液冷凍干燥濃縮后，加入100％甲醇溶解，13000rpm離心

27、30min，取出上清液。再用少量的H2O/MeOH(9:1)溶液溶解，加載到自己填充好的ODS柱子(2×10cm，10μm)，再用H2O/MeOH(9:1)溶液洗脫，收集洗脫液，UPLC-MS/MS測定每一份洗脫液，合并含有代謝物組分的洗脫液，濃縮后，進行核磁分析(BRUKER300，inCD3OD，75MHzfor13C)。在核磁分析中，它的碳信號跟先前的文獻報道的物質14-脫氧-12-磺酸化-穿心蓮內酯非常相似。在灌流實驗中，統計分