顳下頜關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中PRG4表達(dá)調(diào)控及TGF-β1誘導(dǎo)軟骨化生作用機(jī)制研究.pdf

1、顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(temporomandibularjointdisorder，TMD)是口腔醫(yī)學(xué)臨床中常見病之一，盡管研究日益深入，但由于病因復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明。滑膜組織作為關(guān)節(jié)內(nèi)重要組成部分，在TMD發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。目前，已有大量體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)從滑膜組織分離培養(yǎng)的滑膜成纖維細(xì)胞(synovialfibroblasts，SFs)區(qū)別于從非滑膜部位分離的成纖維細(xì)胞，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。本課題以大鼠顳下頜關(guān)節(jié)

2、(temporomandibularjoint，TMJ)雙板區(qū)滑膜組織分離培養(yǎng)的SFs作為研究對象，分析SFs的潤滑功能，成軟骨分化及滑膜襯里重構(gòu)的調(diào)控，以探討SFs參與TMJ的適應(yīng)性改建，維持關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的相關(guān)分子機(jī)制。
　　 第一部分大鼠滑膜細(xì)胞PRG4表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究
　　 目的：蛋白多糖4(proteoglycan4，PRG4)是存在于關(guān)節(jié)滑液和軟骨表面的大分子分泌糖蛋白，它在關(guān)節(jié)邊界潤滑體系中起主導(dǎo)作用，其表

3、達(dá)在轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、分泌等環(huán)節(jié)受應(yīng)力和細(xì)胞因子的調(diào)控。本研究以原代培養(yǎng)的大鼠TMJ雙板區(qū)的滑膜細(xì)胞為模型，觀察相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β1、TNF-α及應(yīng)力負(fù)荷對滑膜細(xì)胞PRG4轉(zhuǎn)錄和合成分泌水平的影響，從生物力學(xué)角度初步探討PRG4表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制。
　　 方法：取SD大鼠TMJ雙板區(qū)平滑光亮的滑膜組織，采用組織塊法分離培養(yǎng)滑膜細(xì)胞，并經(jīng)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行鑒定。利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測不同濃度TGF-β1、TNF-α

4、及間歇靜壓力(intermittenthydrostaticpressure，IHP)作用下PRG4mRNA的表達(dá)；免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、Elisa技術(shù)檢測一定濃度的TGF-β1、TNF-α及IHP作用下PRG4蛋白的表達(dá)。Westernblot和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)分別檢測Smad通路和P38MAPK通路相關(guān)蛋白在應(yīng)力作用下表達(dá)，通過應(yīng)用SB431542，觀察阻斷Smad通路對應(yīng)力誘導(dǎo)PRG4表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：所有培養(yǎng)的滑

5、膜細(xì)胞均對CD68蛋白表達(dá)陰性，vimentin蛋白表達(dá)陽性，并具有成纖維細(xì)胞的特點(diǎn)，是滑膜成纖維細(xì)胞(synovialfibroblasts，SFs)。PRG4mRNA和蛋白表達(dá)水平隨著TGF-β1濃度的增加和作用時間的延長而表達(dá)增多，呈現(xiàn)一定的劑量和時間依賴性；而不同濃度TNF-α對PRG4mRNA的表達(dá)均有抑制作用，其抑制效應(yīng)呈劑量依賴性，且隨著一定濃度TNF-α干預(yù)時間延長，PRG4蛋白表達(dá)呈現(xiàn)一定的時效性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)IHP和

6、TGF-β1之間存在協(xié)同刺激PRG4mRNA和蛋白表達(dá)作用，同時IHP在一定程度上抵消了TNF-α對PRG4表達(dá)的抑制作用。IHP作用使Smad2/3磷酸化水平的增加及Smad2/3蛋白核轉(zhuǎn)位，但不能激活SFs內(nèi)P38MAPK信號通路。應(yīng)用SB431542阻斷Smad通路能夠抑制IHP促進(jìn)PRG4表達(dá)的效應(yīng)。
　　 結(jié)論：適當(dāng)?shù)膽?yīng)力負(fù)荷可協(xié)同增強(qiáng)TGF-β1對PRG4表達(dá)的正向調(diào)控作用，且能一定程度緩解炎癥因子TNF-α對PRG

7、4表達(dá)的抑制作用。Smad信號通路是參與應(yīng)力刺激對PRG4表達(dá)調(diào)控的一條重要途徑。
　　 第二部分TGF-β1通過RhoA/ROCK通路調(diào)控滑膜細(xì)胞軟骨分化的初步研究
　　 目的：SFs屬于聞充質(zhì)來源細(xì)胞，具有軟骨化生能力，在關(guān)節(jié)損傷后的修復(fù)及適應(yīng)性改建過程中起到重要作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transfectgrowthfactor-β1，TGF-β1)是關(guān)節(jié)軟骨組織工程研究的首選生長因子，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)

8、的合成與分泌，調(diào)節(jié)骨及軟骨組織的修復(fù)重建作用。本研究通過TGF-β1誘導(dǎo)大鼠SFs向軟骨細(xì)胞分化，探討RhoA/ROCK信號通路在TGF-β1誘導(dǎo)的SFs表型轉(zhuǎn)化及軟骨相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控過程中的作用及意義。
　　 方法：由大鼠TMJ中分離培養(yǎng)SFs，在體外經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)培養(yǎng)，采用RhoA活性測定及實(shí)時熒光定量PCR方法檢測TGF-β1刺激前后細(xì)胞中RhoA/ROCK信號通路的改變。熒光顯微鏡觀察SFs骨架蛋白F-actin的改

9、變。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)研究TGF-β1誘導(dǎo)的SFs成軟骨特征性基因(Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、aggrecan和Sox9)表達(dá)的影響。觀察并比較加入特異性抑制劑hydroxyfasudil和Y27632阻斷RhoA/ROCK通路對上述TGF-β1作用效應(yīng)的影響。Westernblot技術(shù)檢測Y27632作用TGF-β1下游信號分子Smad2/3磷酸化水平的改變。
　　 結(jié)果：TGF-β1刺激SFs后，細(xì)胞中活化RhoA表達(dá)量和RO

10、CKmRNA表達(dá)量明顯增加，呈現(xiàn)時間依賴性趨勢。TGF-β1的誘導(dǎo)對SFs細(xì)胞骨架F-actin具有重組作用，且該現(xiàn)象分別被RhoA/ROCK通路抑制劑hydroxyfasudil和Y27632特異性地阻斷。Hydroxyfasudil和Y27632在不同程度上抑制了SFs經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)分化后Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、aggrecan和Sox9mRNA表達(dá)。TGF-β1誘導(dǎo)的Smad2/3蛋白磷酸化表達(dá)被一定濃度的Y27632作用所抑制。

11、
　　 結(jié)論：TGF-β1能夠激活RhoA/ROCK信號通路并誘導(dǎo)F-actin骨架重組效應(yīng)，抑制RhoA/ROCK信號通路后其對TGF-β1誘導(dǎo)的SFs軟骨分化的抑制作用可能與其對TGF-β/Smad信號通路活性的下調(diào)相關(guān)。
　　 第三部分應(yīng)力和TNF-α對滑膜細(xì)胞cadherin-11表達(dá)及調(diào)控機(jī)制研究
　　 目的：鈣粘蛋白-11(cadherin-11)是一種滑膜組織特異性表達(dá)的鈣粘蛋白，在滑膜形成、滑膜炎

12、癥和軟骨破壞中發(fā)揮著重要的作用。本研究考察了體外培養(yǎng)的SFs在應(yīng)力作用和炎癥因子TNF-α刺激下，cadherin-11的分布、表達(dá)的改變，并進(jìn)一步探討PI3K/Akt信號通路在其過程中發(fā)揮的調(diào)控作用。
　　 方法：由大鼠TMJ中分離培養(yǎng)SFs，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)染色并觀察正常SFscadherin-11蛋白分布情況；采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)及Westernblotg檢測不同大小應(yīng)力和一定濃度TNF-α作用不同時間后cadh

13、erin-11mRNA與蛋白水平表達(dá)的變化。Westernblot技術(shù)檢測PI3K/Akt信號通路多種信號蛋白表達(dá)，觀察應(yīng)用特異性阻斷劑LY294002阻斷PI3K/Akt通路對cadherin-11mRNA與蛋白水平表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：熒光顯微鏡下觀察cadherin-11蛋白位于相鄰兩SFs接觸的邊緣，與F-actin骨架連接緊密。持續(xù)HP作用12h能刺激cadherin-11mRNA與蛋白表達(dá)，并呈力值大小依賴關(guān)系。

14、經(jīng)10ng/mlTNF-α刺激后，cadherin-11mRNA與蛋白表達(dá)量隨著TNF-α作用時間的延長而逐漸升高，呈一定的時間依賴關(guān)系。10ng/mlTNF-α和90kPa持續(xù)HP均能明顯增強(qiáng)SFs內(nèi)PI3K、Akt蛋白磷酸化水平。Akt磷酸化抑制劑LY294002能夠明顯降低SFs相應(yīng)蛋白磷酸化水平。TNF-α和持續(xù)HP能夠明顯增強(qiáng)cadherin-11基因表達(dá)，并促進(jìn)蛋白表達(dá)，該誘導(dǎo)激活作用可被LY294002阻斷。