黃鱔生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)家族的肌肉的克隆與營養(yǎng)調(diào)控及進化分析.pdf

1、黃鱔作為“水中人參”，肉質(zhì)細嫩，鮮美可口，營養(yǎng)價值高，能夠?qū)崿F(xiàn)人工養(yǎng)殖而日益受到關(guān)注。然而野生黃鱔生長緩慢，肌肉作為魚類最主要的可食用部分受到多種因素的調(diào)控，生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)對肌肉的發(fā)生起著重要的調(diào)控作用，本文主要以生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)的表達作為分子判斷標準，以冰凍切片作為肌纖維形態(tài)觀察的手段，分別從MRFs家族基因的克隆以及種屬特異性分析、不同發(fā)育階段的表達與形態(tài)觀察、應對肌肉損傷的修復過程與機理、不同濃度大豆?jié)饪s蛋白替代

2、魚粉對生長的影響并結(jié)合線粒體基因組，分析黃鱔的種質(zhì)資源情況，以期為黃鱔的規(guī)?；B(yǎng)殖提供技術(shù)支持，并為進一步黃鱔的遺傳育種提供遺傳背景支持。本研究主要得到以下結(jié)果:
　　1、采用常規(guī)PCR和RACE技術(shù)成功克隆了黃鱔生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)家族的全部基因，通過與NCBI上斑馬魚的序列進行比對，分別命名Myf5、MyoD1，MyoD2、MyoG、MRF4。Genbank登錄號分別為KM103285、KM103286、KM103287、

3、KM103288和KM103283。比較MRFs家族的基因結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，這些基因具有相似的結(jié)構(gòu)特征，其結(jié)構(gòu)都是包含一個位于靠近5'端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，一個富含堿性氨基酸的區(qū)域，以及一個堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域(basichelix-loop-helix，bHLH)以及一個染色體激活區(qū)域(CTD)。在所有MRFs成員中，均由65個氨基酸殘基組成了的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域(basic helix-loop-helix，bHLH)保守區(qū)域。蛋白比對顯示

4、這些基因在物種之間比較保守，而進化分析顯示這些基因在進化上區(qū)分的很快，其中MRFs家族中的五個基因首先是分成了兩支:Myf5、MyoD1、MyoD2聚成一支，而MyoG和MRF4另外聚成一支。這與他們在功能上的分為兩類是一致的。另外進化分析結(jié)果顯示黃鱔和鱸形目魚類的親緣關(guān)系最近，這對我們以后克隆黃鱔基因選擇同源物種具有重要意義。
　　2、我們分析了MRFs家族的5個基因在黃鱔不同發(fā)育階段的時空表達特異性和黃鱔在不同發(fā)育階段的肌纖維

5、發(fā)育規(guī)律，同時也通過冰凍切片，并運用SDH酶染色技術(shù)進行探討肌纖維的分布類型以及組成規(guī)律。結(jié)果顯示MRFs在黃鱔肌纖維的發(fā)育過程中起著重要作用，肌纖維的增粗和增殖與MRFs家族的時空表達情況密切相關(guān)。黃鱔肌纖維鑲嵌在不同的結(jié)締組織之間，直徑主要分布在80-200μm之間，隨著黃鱔體重的不斷增加，平均纖維直徑也在不斷的增長，從5g時候的平均纖維直徑34±0.47μm到114g時平均纖維直徑達到最大153±7.25μm。在黃鱔幼魚中，纖維直

6、徑＜20μm的頻率顯著大于其他階段，并隨著體重的增加，纖維直徑＞60μm的頻率也在增加。另外我們發(fā)現(xiàn)在黃鱔體重＜114g之前，黃鱔肌肉的發(fā)育主要以肌纖維的增粗為主，而超過114g之后，明顯的觀察到了黃鱔肌纖維的重新生成。
　　3、通過對比牛磺酸投喂的黃鱔和正常飼料投喂黃鱔在面對鹽酸布比卡因注射損傷時，生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)的表達變化情況和相應采用冰凍切片技術(shù)分析，肌纖維的恢復過程，結(jié)果顯示?；撬釋∪馐軗p的恢復具有一定的促進作用

7、。
　　4、我們探討了不同濃度大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉對黃鱔幼魚的影響，結(jié)果顯示大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉不超過48％的情況下不會影響到黃鱔幼魚的生長，然而高濃度的大豆?jié)饪s蛋白替代水平會降低黃鱔幼魚的生長，消化酶，蛋白酶活性和改變生肌調(diào)節(jié)因子家族的時空表達模式。
　　5、我們克隆了來自貴州、廣西、湖南以及廣東等四個地方的野生黃鱔線粒體基因組序列，全長均為16，622bp，并上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得Genbank序列號KP779622

8、-KP779625。同時我們比較了4個不同地域的黃鱔線粒體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)他們和其它硬骨魚類類似，均包含13個編碼蛋白基因，22個tRNA基因，2個rRNA基因以及一個控制區(qū)。線粒體基因組具有自己的遺傳模式，因此我們比較了4個不同地域的黃鱔線粒體的密碼子使用特點，發(fā)現(xiàn)黃鱔線粒體基因組中G堿基使用頻率非常低僅為14.45％-14.58％，同時黃鱔線粒體基因組中具有明顯的偏A堿基和C堿基(AT-skew=0.03，GC-skews=-0.34)。

9、
　　為了評估黃鱔線粒體的遺傳多樣性，我們分析了四個不同地域黃鱔線粒體的多態(tài)性，在整個線粒體的13個編碼蛋白基因組中，我們共發(fā)現(xiàn)了469個多態(tài)性位點。占整個線粒體編碼基因的0.04。在所有的469個多態(tài)性位點中有266個位點位于ND1-ND6基因。108個位點位于CO1-CO3，50個在ATP8和ATP6基因中發(fā)現(xiàn)，剩下的45個位于CYTB基因。
　　同時在黃鱔的13個編碼蛋白基因中，多態(tài)性最高的為ND5(71)，最低為ND