水牛卵丘細(xì)胞主要能量供給途徑及葡萄糖對其生長特性影響的初探.pdf

1、葡萄糖是動物體內(nèi)重要的營養(yǎng)物質(zhì)，直接或間接參與動物體的新陳代謝過程。研究表明葡萄糖是哺乳動物卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育的重要能量來源，并且參與了卵丘擴(kuò)展、卵母細(xì)胞成熟以及早期胚胎發(fā)育的分子調(diào)控過程。本研究首先探討水牛卵丘細(xì)胞能量供給的主要途徑，在此基礎(chǔ)上，初步探討葡萄糖對水牛卵丘細(xì)胞生長特性的影響，以期為進(jìn)一步優(yōu)化卵丘細(xì)胞培養(yǎng)條件，改善卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系奠定基礎(chǔ)。首先在體外培養(yǎng)的第二代水牛卵丘細(xì)胞的培養(yǎng)液中分別加入氧化磷酸化

2、途徑抑制劑、磷酸戊糖途徑抑制劑以及糖酵解途徑抑制劑，觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，并利用ATP生物熒光法檢測葡萄糖代謝中相關(guān)途徑被抑制后細(xì)胞的產(chǎn)能變化情況。結(jié)果顯示:氧化磷酸化途徑被抑制后，水牛卵丘細(xì)胞生長狀態(tài)正常，細(xì)胞產(chǎn)能變化不顯著(P＞0.05)。磷酸戊糖途徑被抑制后，水牛卵丘細(xì)胞產(chǎn)能減少，但細(xì)胞依然維持正常的生長狀態(tài)。糖酵解途徑被抑制后，水牛卵丘細(xì)胞的生長狀態(tài)會受不同程度的影響，細(xì)胞產(chǎn)能與其糖酵解途徑受抑制程度呈現(xiàn)出梯度變化。糖酵解途徑和磷

3、酸戊糖途徑被抑制后，細(xì)胞的產(chǎn)能均顯著減少(P＜0.05)，但糖酵解途徑被抑制后細(xì)胞產(chǎn)能減少的程度高于磷酸戊糖途徑產(chǎn)能減少的程度(61.46％vs24.7％)。其次，分別利用不同濃度葡萄糖（0g/L、1g/L、4.5g/L和9g/L）處理水牛卵丘細(xì)胞48h，探討葡萄糖對水牛卵丘細(xì)胞生長特性的影響，包括細(xì)胞生長趨勢、細(xì)胞倍增時間、細(xì)胞增殖水平、細(xì)胞凋亡情況和細(xì)胞對葡萄糖的利用率等。結(jié)果顯示:不同濃度葡萄糖作用下水牛卵丘細(xì)胞形態(tài)無明顯區(qū)別，細(xì)

4、胞生長曲線均呈現(xiàn)“S”型。但細(xì)胞培養(yǎng)液中不含葡萄糖，水牛卵丘細(xì)胞生長趨勢相對緩慢，增殖能力較弱。1g/L和4.5g/L濃度葡萄糖處理組細(xì)胞生長趨勢相似，與對照組相比，兩組細(xì)胞倍增時間縮短，細(xì)胞增殖能力極顯著提高(P＜0.01)，以及細(xì)胞凋亡率顯著下降(P＜0.05)，但4.5g/L處理組的水牛卵丘細(xì)胞對葡萄糖利用率極顯著高于1g/L處理組(P＜0.01)。細(xì)胞培養(yǎng)液中添加9g/L葡萄糖，在一定時間內(nèi)有刺激卵丘細(xì)胞增殖的效應(yīng)，但隨作用時間

5、延長此效應(yīng)消失，并出現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖的現(xiàn)象。利用熒光定量PCR檢測水牛卵丘細(xì)胞糖酵解相關(guān)基因mRNA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn):4.5g/L處理組細(xì)胞糖酵解相關(guān)基因HK、PFK和LDH的mRNA表達(dá)量均顯著高于0g/L、1g/L和9g/L處理組。上述結(jié)果表明:(1)糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑是體外培養(yǎng)水牛卵丘細(xì)胞的主要能量供給途徑，其中糖酵解途徑的產(chǎn)能作用更為突出，而水牛卵丘細(xì)胞極少利用氧化磷酸化途徑產(chǎn)能;(2)適宜葡萄糖濃度(4.5g/L)可促進(jìn)