中醫(yī)圓道理論指導(dǎo)下模擬微重力對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化潛能的影響.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在組織生物工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。然而有很多問(wèn)題尚未解決，比如干細(xì)胞分化的效率，種子細(xì)胞的數(shù)量以及干細(xì)胞恰當(dāng)?shù)囊浦卜椒ǖ?。?duì)于干細(xì)胞的分化，主要誘導(dǎo)方法是采用基因重編碼或是化學(xué)特殊誘導(dǎo)因子，盡管這些方法可以成功實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)，但是他們所引起的致瘤性及過(guò)度分化等問(wèn)題一直受到研究者的關(guān)心。如果能從干細(xì)胞本身著手，大大提高干細(xì)胞的分化潛能，這將有望有效的提高干細(xì)胞的誘導(dǎo)效率，但是目前尚無(wú)特異性提高干細(xì)胞自身分化潛能的有

2、效手段。
　　在過(guò)去40年中，太空航天事業(yè)的發(fā)展讓人們認(rèn)識(shí)到微重力對(duì)生物有著重大的影響。其中包括腦脊液流動(dòng)改變，體液電解質(zhì)喪失，肌肉萎縮，免疫系統(tǒng)功能下降等。同樣,微重力會(huì)改變細(xì)胞的一些性質(zhì)，包括細(xì)胞的形態(tài)功能和細(xì)胞對(duì)環(huán)境的反應(yīng)。我們的研究發(fā)現(xiàn)微重力干預(yù)后MSCs細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，由長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)變?yōu)轭?lèi)圓形。―形者神之質(zhì)，神者形之用‖，形態(tài)的改變必然導(dǎo)致其功能的變化。在中醫(yī)圓道理論指導(dǎo)下，我們認(rèn)為細(xì)胞圓形的改變正是一種原始狀態(tài)的回歸

3、。圓形的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否具有更高的分化潛能。本研究采用地面回轉(zhuǎn)培養(yǎng)器（2D-clinostat）模擬細(xì)胞在空間中的受力情況，以地面正常1g重力（Normalgravity,NG）作為對(duì)照，研究模擬微重力（simulatedmicrogravity,SMG）干預(yù)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化以及向內(nèi)皮細(xì)胞分化的能力，同時(shí)探討微重力通過(guò)對(duì)細(xì)胞骨架以及關(guān)鍵分子RhoA活性的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，從而指導(dǎo)干細(xì)胞向不同方向分化的機(jī)制。本研究首次提出細(xì)胞

4、形態(tài)對(duì)于干細(xì)胞誘導(dǎo)效率有重大意義，并依據(jù)中醫(yī)―圓道‖觀提出SMG刺激來(lái)提高干細(xì)胞誘導(dǎo)的新策略，有望實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞高效率高安全性的誘導(dǎo)，為干細(xì)胞廣泛安全的運(yùn)用于臨床提供新的思路。
　　實(shí)驗(yàn)一模擬微重力干預(yù)促進(jìn)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化
　　目的：觀察SMG致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)、凋亡及多潛能指標(biāo)的改變，并對(duì)SMG作用后MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化效率進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　方法：原代培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定，實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為2

5、D-clinostat干預(yù)的SMG培養(yǎng)組與NG對(duì)照培養(yǎng)組；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)分析凋亡，反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)多潛能標(biāo)志OCT4表達(dá)的變化，激光共聚焦、流式細(xì)胞術(shù)、real-timePCR觀察誘導(dǎo)后神經(jīng)樣細(xì)胞MAP-2、CHAT、TH的表達(dá)，ELISA及real-timePCR檢測(cè)細(xì)胞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)水平，同時(shí)應(yīng)用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)后神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢蛔兓?br>　　結(jié)果：①M(fèi)SCs的培養(yǎng)與鑒定：所培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)

6、鑒定，表達(dá)CD9097.37％和CD4494.35％，表達(dá)CD45陰性。②SMG72小時(shí)左右后細(xì)胞形態(tài)及凋亡變化：通過(guò)r值（細(xì)胞長(zhǎng)軸和短軸的比值）反應(yīng)細(xì)胞變圓程度，采用MetaMorph7.1software分析SMG組細(xì)胞明顯趨于圓形（p<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)有凋亡。③細(xì)胞多潛能標(biāo)志物OCT4表達(dá)：微重力干預(yù)24小時(shí)后OCT4的表達(dá)明顯升高（p<0.05）。隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)變化不明顯。④誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞MAP-2/CH

7、AT/TH表達(dá)：a.PCR檢測(cè)微重力干預(yù)后分化的神經(jīng)樣細(xì)胞表達(dá)更高M(jìn)AP-2，CHAT,TH水平。對(duì)于MAP-2的表達(dá)，在分化7天和14天表達(dá)水平約是正常重力組兩倍（p<0.05）；對(duì)于TH的表達(dá)，在分化14天時(shí)表達(dá)水平增高約1.5倍（p<0.05）；對(duì)于CHAT的表達(dá)，在分化7天時(shí)表達(dá)水平是正常重力組1.7倍（p<0.05）。b.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表達(dá)MAP-2,CHAT,TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：微重力干預(yù)組明顯高于正常重力組。微重力組MAP-2

8、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)48.03％±2.33％，正常重力組37.22％±1.98％；微重力組TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)17.45％±1.26％，正常重力組14.06±1.95％；微重力組CHAT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5.53％±1.32％，正常重力組2.96％±1.58％。⑤神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)：在誘導(dǎo)前，微重力明顯提高M(jìn)SCs分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的濃度。其中BDNF濃度比正常重力組增加了100％，（p<0.05）,CNTF濃度增加了85％（p<0.05）。在分化7天后，CNT

9、F濃度比正常重力組提高了50％（p<0.05）,其他未見(jiàn)有明顯差異。同時(shí)MSCs在分化前比分化后分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子濃度更高。PCR進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)果。⑥動(dòng)作電位：微重力干預(yù)后MSCs分化的神經(jīng)樣細(xì)胞表現(xiàn)為更具成熟特性的動(dòng)作電位特征。微重力組細(xì)胞動(dòng)作電位幅度及頻次明顯高于正常重力組。
　　結(jié)論：SMG作用下圓形的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化能力更高。
　　結(jié)論：SMG作用下圓形的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化能力更高。

10、>　　實(shí)驗(yàn)二模擬微重力干預(yù)促進(jìn)MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化
　　目的：對(duì)SMG作用后MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化效率進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　方法：原代培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為2D-clinostat干預(yù)的SMG培養(yǎng)組與NG對(duì)照培養(yǎng)組；免疫熒光及反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)vWF、Flk-1量，采用DiI-Ac-LDL吞噬實(shí)驗(yàn)及體外血管成形實(shí)驗(yàn)的試劑盒檢測(cè)兩組誘導(dǎo)后內(nèi)皮細(xì)胞的功能差異。
　　結(jié)果：①免疫熒光檢測(cè)：以分化前MS

11、Cs為空白對(duì)照，微重力干預(yù)組內(nèi)皮樣細(xì)胞表達(dá)vWF和Flk-1量明顯高于正常重力組。分化前MSCs未見(jiàn)表達(dá)vWF和Flk-1。②反轉(zhuǎn)錄PCR:微重力干預(yù)后的MSCs分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞表達(dá)vWF水平是正常重力組的2.8倍（p<0.05）；表達(dá)Flk-1水平是正常重力組的1.6倍（p<0.05）。微重力處理明顯促進(jìn)MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞的分化。③DiI-Ac-LDL吞噬實(shí)驗(yàn)：兩組分化后的內(nèi)皮細(xì)胞都具有攝取脂質(zhì)的能力，兩組間未見(jiàn)有明顯差異。然而對(duì)于未

12、分化的MSCs兩組都未見(jiàn)有攝取現(xiàn)象。④體外血管成形實(shí)驗(yàn)：softwareImageJ分析軟件分析成管面積,成管長(zhǎng)度差異。分化6天后微重力組成環(huán)面積和長(zhǎng)度都明顯高于正常重力組（p<0.05）。
　　結(jié)論：SMG作用下圓形的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的分化能力更高。
　　實(shí)驗(yàn)三細(xì)胞骨架和RhoA共同調(diào)節(jié)微重力對(duì)MSCs分化的影響
　　目的：觀察不同時(shí)間段微重力作用對(duì)細(xì)胞骨架和RhoA活性的變化，初步探討其影響MSCs向不同

13、方向分化的機(jī)制。
　　方法：原代培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為短時(shí)間干預(yù)SMG72h組、長(zhǎng)時(shí)間干預(yù)SMG10d組與NG對(duì)照培養(yǎng)組；激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞骨架α-actin、Microtubules變化。將不同組細(xì)胞向神經(jīng)方向，內(nèi)皮方向、成脂方向、成骨方向誘導(dǎo)分化10天，反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)不同組分化的效率。RhoGTPasepull-downAssay檢測(cè)不同組RhoA的活性變化。RhoA活性阻滯劑ExoenzymeC3Trans

14、ferase干預(yù)后檢測(cè)MSCs分化能力的變化。
　　結(jié)果：①鬼筆環(huán)肽對(duì)不同組MSCs細(xì)胞骨架α-actin的標(biāo)記。短時(shí)間微重力處理細(xì)胞骨架張力下降，表達(dá)減低。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，微重力處理10天后微絲表達(dá)有所恢復(fù)，骨架張力升高。②β-tubulin對(duì)不同組MSCs細(xì)胞骨架微管蛋白的標(biāo)記。短時(shí)間微重力處理微管崩解，模糊不清，表達(dá)減低。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，微重力處理10天后微管有所聚集，微管蛋白表達(dá)有所恢復(fù)。③向內(nèi)皮誘導(dǎo)：SMG72h誘導(dǎo)的細(xì)胞表

15、達(dá)vWF水平增高，是正常重力組的1.6倍（p<0.05），然而當(dāng)微重力處理時(shí)間為10天后，誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)vWF水平明顯下降。④向神經(jīng)方向誘導(dǎo)：SMG72h誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)MAP-2水平增高，是正常重力組的2倍（p<0.05），SMG10天后，MAP-2水平明顯下降，基本和正常重力組表達(dá)水平一致，同SMG72h組比較，差異顯著（p<0.05）。⑤向成骨誘導(dǎo)：SMG72hALP水平減低，約是正常重力組的0.6倍（p<0.05），然而當(dāng)SMG1

16、0天后，誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)ALP水平明顯增加，同微重力72h組比較，差異顯著（p<0.05）。⑥向成脂誘導(dǎo)：SMG72h組表達(dá)PPARγ2水平明顯增加，約是正常重力組的1.6倍（p<0.05），然而SMG10天后，誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)PPARγ2水平明顯下降，同SMG72h組比較，差異顯著（p<0.05）。⑦總RhoA表達(dá)量在干預(yù)各組沒(méi)有明顯變化，然而活化RhoA的表達(dá)量SMG72h組明顯下降，與正常重力組相比下降約80％（p<0.05）；但是S

17、MG10天后RhoA的活性顯著回升，與72h處理組相比高出約10倍，與正常重力組相比表達(dá)水平升高約60％（p<0.05）。⑧RhoA阻滯劑干預(yù)后，SMG10d組分化的能力被逆轉(zhuǎn)，成骨方向分化能力明顯下降，ALP表達(dá)下降80％（p<0.05）；成脂方向分化能力增加，PPARγ2表達(dá)水平提高約3倍（p<0.05）。
　　結(jié)論：微重力不同作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞骨架張力的改變和微管的聚散很可能是通過(guò)RhoA調(diào)節(jié)作用。當(dāng)短時(shí)間干預(yù)MSCs，降低了R