蜂毒明肽介導(dǎo)脊髓損傷靶向治療的研究.pdf

1、脊髓損傷(SCI)是一種由機(jī)械創(chuàng)傷、炎癥及其他因素造成的脊髓病理損傷的疾病，是脊柱損傷中最嚴(yán)重的一種并發(fā)癥。脊髓損傷往往導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下肢體嚴(yán)重的功能障礙，因此患者不得不接受長期甚至終身的治療和護(hù)理。這不僅給患者本人帶來身體和心理的嚴(yán)重傷害，還給患者家庭及整個社會造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管在脊髓損傷治療過程中，已經(jīng)在藥學(xué)和手術(shù)治療方面獲得了一些經(jīng)驗(yàn)，但是目前臨床上對脊損損傷的治療與康復(fù)仍然沒有切實(shí)有效的治療方案和藥物，這對患者及其親屬乃

2、至主治醫(yī)生而言都是一個巨大的困擾。目前臨床公認(rèn)的用于治療脊髓損傷的藥物以甲基強(qiáng)的松龍(MP)為主。然而大量的臨床經(jīng)驗(yàn)表明甲基強(qiáng)的松龍對脊髓損傷的治療效果有限，而其副作用卻非常明顯。此外，現(xiàn)在臨床上使用的大劑量甲基強(qiáng)的松龍沖擊療法也受到了質(zhì)疑。因?yàn)榇髣┝考谆鶑?qiáng)的松龍?jiān)谥委熂顾钃p傷的同時也會引起嚴(yán)重的感染甚至可以導(dǎo)致死亡。因此在脊髓損傷治療方面亟需探索出更為有效的藥物和治療手段來滿足臨床需要。
　　本研究的目的在于，構(gòu)建以蜂毒明肽(a

3、pamin)為導(dǎo)向分子的主動靶向性遞藥系統(tǒng)治療脊髓損傷，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究的內(nèi)容主要包括:蜂毒明肽修飾的聚合物膠束的制備及表征和靶向聚合物膠束的體內(nèi)評價(jià)兩個方面。首先以中樞神經(jīng)系統(tǒng)高親和性的蜂毒明肽作為靶向分子，以兩親性高分子材料聚乙二醇-二硬脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)作為藥物載體材料，以具有抗炎、抗氧化藥效的脂溶性化合物姜黃素(CUR)作為模型藥物，選用以上三種臨床上正在使用或者正在進(jìn)行臨床

4、實(shí)驗(yàn)的成分來構(gòu)建靶向膠束給藥系統(tǒng)apamin-PM-CUR。然后，建立小鼠脊髓損傷模型，并從行為學(xué)、電生理學(xué)及組織學(xué)三個方面對治療后造模小鼠恢復(fù)情況進(jìn)行評價(jià)。最后對所構(gòu)建的靶向膠束給藥系統(tǒng)apamin-PM-CUR的安全性進(jìn)行評估。具體實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果如下。
　　蜂毒明肽修飾的聚合物膠束的制備及表征。首先利用蜂毒明肽的活性氨基基團(tuán)和NHS活化PEG-DSPE之間的酰胺反應(yīng)合成得到生物靶向材料apamin-PEG-DSPE，用核磁共振

5、氫譜儀和生物質(zhì)譜儀對產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和分子量測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過該法可以成功合成聚合物膠束靶向材料apamin-PEG-DSPE。然后以脂溶性的姜黃素作為模型藥物，采用薄膜水化法制備apamin-PM-CUR和PM-CUR膠束。所制備膠束并測得膠束粒徑可達(dá)50nm，大小均一，分散良好，包封率為79.11％。通過X-射線光電子能譜(X-PS)分析和X-射線粉末衍射(X-RD)分析實(shí)驗(yàn)可知，膠束表面確實(shí)有修飾的多肽存在，而且姜黃素在聚合物

6、膠束中也完全包載。膠束在4℃放置3個月后，并未發(fā)現(xiàn)有姜黃素泄露，自身的粒徑和分散性也無明顯變化。體外釋放度實(shí)驗(yàn)表明apamin-PM-CUR和PM-CUR在釋放度上無明顯區(qū)別，由此可見蜂毒明肽的修飾并不影響膠束的釋藥行為。
　　蜂毒明肽膠束的體內(nèi)評價(jià)。首先，采用Allen's垂直重物打擊法建立小鼠脊髓損傷模型，通過BMS評分、MEP檢測以及組織學(xué)觀察結(jié)果證實(shí)造模成功。然后，在正式實(shí)驗(yàn)中將造模小鼠分為apamin-PM-CUR組、P

7、M-CUR、甲基強(qiáng)的松龍組和生理鹽水組連續(xù)給藥7天，從行為學(xué)（BMS評分）、電生理學(xué)(MEP)、組織學(xué)（H&E、HRP染色）3個水平對各組造模小鼠恢復(fù)情況進(jìn)行評估。實(shí)驗(yàn)證明，PM-CUR組與生理鹽水組情況類似小鼠恢復(fù)情況并不好。該組小鼠存活率低，僅存的少數(shù)小鼠直到給藥后24周下肢仍然不能自由活動，MEP-N1潛伏期也大于10ms，說明該組小鼠神經(jīng)通路受阻。通過組織切片可知該組小鼠損傷組織部位炎癥嚴(yán)重，脊髓的結(jié)構(gòu)完整性和功能完全性并未得到

8、恢復(fù)。相反的apamin-PM-CUR組小鼠恢復(fù)良好，恢復(fù)效果甚至優(yōu)于陽性對照MP組小鼠的狀況。該組小鼠在給藥后24周，小鼠存活率約為80％，而且下肢能夠較為協(xié)調(diào)地運(yùn)動，神經(jīng)通路恢復(fù)良好，受損脊髓部位神經(jīng)元再生較多，組織空洞減少，神經(jīng)功能恢復(fù)較好。在安全性方面，靶向膠束中的apamin含量大約是apamin-PEG-DSPELD50的1/700，EEG實(shí)驗(yàn)可以證明在低于100mg/kg的給藥劑量下，注射apamin-PEG-DSPE的小

9、鼠腦電波和生理鹽水組小鼠腦電圖相似，振幅穩(wěn)定、波動平穩(wěn)。充分說明經(jīng)PEG-DSPE定點(diǎn)修飾的apamin具有很好的安全性。
　　綜上所述，本文設(shè)計(jì)并制備了由生物多肽修飾的靶向遞藥系統(tǒng)，借助主動靶向遞送策略，解決了藥物不能足量進(jìn)入脊髓損傷部位的問題，并通過多種途徑，證明了該遞藥系統(tǒng)在體內(nèi)能夠表現(xiàn)出良好的藥效和較理想的治療指數(shù)。高效低毒是藥物研究的長遠(yuǎn)目標(biāo)，本研究工作可為脊髓損傷以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)