西地那非-H2S釋放劑(ACS6)對同型半胱氨酸損傷PC12細(xì)胞的拮抗作用及機(jī)制.pdf

1、【研究背景與目的】
　　同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是阿爾茲海默病的高風(fēng)險因子,氧化應(yīng)激是其神經(jīng)毒性作用的機(jī)制之一。Hcy在自身氧化過程中會產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS),從而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和促凋亡。硫化氫(hydrogen sulfide, H2S)不僅是體內(nèi)重要的內(nèi)源性神經(jīng)調(diào)質(zhì),而且還是一種新的神經(jīng)保護(hù)劑。它可通過清除活性氧,保護(hù)神經(jīng)元對抗各種氧化應(yīng)激損傷。此外

2、,它還可通過激活A(yù)TP-敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive potassium channel, KATP)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。ACS6是一種新合成的西地那非-H2S釋放劑(H2S-releasing sildenafil),研究證實H2S的釋放在這種新型H2S供體的藥理效應(yīng)中起主導(dǎo)作用。
　　我們前期工作發(fā)現(xiàn)H2S可通過清除活性氧(Reactive oxygen species, ROS)而對抗Hcy的神經(jīng)毒性?；诖?

3、本研究將以Hcy損傷PC12細(xì)胞為Hcy神經(jīng)毒性的細(xì)胞模型,明確ACS6是否對Hcy的神經(jīng)毒性也具有拮抗作用,并探討其拮抗機(jī)制。
　　【方法】
　　采用亞甲基藍(lán)比色法檢測ACS6在細(xì)胞裂解液中H2S的釋放量;CCK-8法(Cell Counting Kit-8 assay)檢測PC12細(xì)胞的活力;Hoechst33258染色后,熒光顯微鏡下觀察 PC12細(xì)胞核染色體形態(tài)改變;碘化丙啶(propidium iodide, PI

4、)染色后流式細(xì)胞儀(Flow Cytometry, FCM)檢測細(xì)胞凋亡率;羅丹明123(Rhodamine123, Rh123)染色后, FCM檢測細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP);2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)染色后,熒光顯微鏡及 FCM法檢測細(xì)胞內(nèi) ROS水平;Western blotting檢測 PC12細(xì)胞對氧磷酶-1(Paraoxonase-1, P

5、ON-1)、細(xì)胞色素c(Cytochrome c, Cytc)、caspase-3、Bcl-2的蛋白表達(dá);分光光度計法檢測 PC12細(xì)胞 PON-1活性。
　　【結(jié)果】
　　1. ACS6對Hcy損傷PC12細(xì)胞的拮抗作用
　　ACS6在4~16μM范圍內(nèi)濃度依賴性地減輕Hcy(5 mM,24 h)對PC12細(xì)胞存活率的抑制作用,ACS6(16μM)能顯著抑制Hcy(5 mM,24 h)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞釋放LDH和細(xì)胞

6、凋亡,表明ACS6對Hcy損傷PC12細(xì)胞具有拮抗作用。
　　2. ACS6拮抗Hcy損傷PC12細(xì)胞的機(jī)制
　　ACS6(16μM)預(yù)處理30 min可減輕Hcy(5 mM,24 h)引起的細(xì)胞內(nèi)ROS的升高和PON-1蛋白表達(dá)及其酶活性的下降;PON-1特異性抑制劑2-羥基喹啉(2-hydroxyquinoline,2-HQ)預(yù)處理30 min可取消ACS6對Hcy促進(jìn)ROS累積和損傷PC12細(xì)胞的拮抗作用,表明ACS6

7、的抗Hcy神經(jīng)毒性作用可能與其上調(diào)PC12細(xì)胞PON-1表達(dá)和活性,抑制ROS生成有關(guān)。
　　ACS6(16μM)預(yù)處理30 min可抑制Hcy(5 mM,24 h)降低PC12細(xì)胞MMP、促進(jìn)Cyt-c釋放、激活Caspase-3和下調(diào)Bcl-2表達(dá),表明ACS6可通過阻斷Hcy激活線粒體凋亡通路而拮抗Hcy的神經(jīng)毒性。
　　ACS6可緩慢持續(xù)釋放H2S,ACS6可對抗Hcy的毒性作用,而母體西地那非對 Hcy的毒性作用無

8、影響。此外,ACS6抗 Hcy神經(jīng)毒性的作用可被 KATP通道特異性阻斷劑格列苯脲(glybenclamide, GLY)阻斷。以上表明 ACS6抗Hcy神經(jīng)毒性的作用依賴于H2S釋放及H2S對KATP通道的激活。
　　【結(jié)論】
　　1. ACS6對Hcy損傷PC12細(xì)胞具有拮抗作用;
　　2. ACS6抗Hcy損傷PC12細(xì)胞的機(jī)理涉及到以下三個方面:
　　(1)促進(jìn)PC12細(xì)胞PON-1蛋白的表達(dá)及其酶活性、